微生物産生脂肪族ポリエステル及びその分解酵素の結晶・表面構造解析

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11217216
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (B)
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 岩田 忠久 理化学研究所, 高分子化学研究室, 研究員 (30281661)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 久野 玉雄 理化学研究所, 高分子化学研究室, 基礎科学特別研究員 (20312267)
• Keywords: 生分解性 / 脂肪族ポリエステル / 単結晶 / 透過型電子顕微鏡 / 分解酵素 / 酵素精製 / 結晶構造 / 表面構造

Research Abstract

これまで我々が行ってきた研究により、微生物産生脂肪族ポリエステルであるポリヒドロキシブタン酸(P(3HB))及びその共重合体の単結晶は、PHB加水分解酵素により結晶の側面から分解されることが明らかになっている。さらに、免疫電子顕微鏡法を用いて単結晶表面への酵素の吸着機構に関する研究を行ったところ、酵素の単結晶表面への吸着には、明確な位置的特異性は認められず、ほぼ均一に吸着することが明らかとなった。現在、様々な生分解性脂肪族ポリエステルの単結晶を生成し、その結晶・表面構造を解析すると共に、酵素による分解機構について検討を行っている。ポリ乳酸については、既に単結晶生成に成功すると共に、酵素分解を行った。さらに詳細な酵素分解機構の検討と他の脂肪族ポリエステル(例えば、ポリ(4-ヒドロキシブタン酸)、ポリ(ブチレンサクシネート)、ポリ(ブチレンアジペート)など)の単結晶生成を遂行している。
一方、P(3HB)分解酵素であるPseudomonas stutzeri YM1006由来の高分子分解酵素のアミノ酸配列の解析により、本酵素は触媒ドメイン、リンカードメイン、2つの基質結合ドメインという4つのドメインから成るモジュール構造を持っていることがわかった。これらのドメイン間はフレキシブルなループで接続されていると考えられ、酵素分子全体は一定のコンフォーメーションをとっていないと思われる。そこで、触媒ドメインだけを切り出してくることにより結晶化が可能になると考え、これまでに全長酵素をプロテアーゼで切断して触媒ドメイン断片を精製する方法を検討してきた。その結果、本酵素はパパインにより345番目のアミノ酸残基(グリシン)のカルボキシル末端側で切断されることが判った。現在、結晶化実験に必要な蛋白質量約100mgを確保するために、触媒ドメイン断片酵素の大量精製を行い、結晶化条件の検討を行っている。