メダカ属魚類の種内・種間交雑個体の環境適応におけるcGMP情報伝達系の役割の解析

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11236202
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (B)
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 鈴木 範男 北海道大学, 大学院・理学研究科, 教授 (20082133)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 日下部 岳広 北海道大学, 大学院・理学研究科, 助手 (40280862)
• Keywords: メダカ / cGMP / 膜結合型グアニル酸シクラーゼ / 可溶性型グアニル酸シクラーゼ / ゲノム / リガンド / 受容体 / プロモーター

Research Abstract

(1)メダカ属魚類のナトリウム利尿ペプチド受容体型グアニル酸シクラーゼ遺伝子:ヒメダカにはナトリウム利尿ペプチド受容体型グアニル酸シクラーゼとして、OlGC1及びOlGC2に加えて、新たにOlGC7が存在することを明らかにし、そのcDNAをクローニングし、塩基配列を決定し、その組織及び発生過程における発現をRNase Protection Assayによって調べ、脳、鰓、腎臓、卵巣に主に発現していることを明らかにした。また、約93kbpのOlGC1のゲノム構造は明らかにしているが、慶応大学グループが作成したBAC libraryを供与してもらい、34kbpのOlGC2のゲノム構造の解析がほぼ完了した。さらに、名古屋大学グループから純系メダカ(HdrR)を供与してもらい、OlG1及びOlGC7はゲノム中に1コピーしか存在しないが、OlGC2は2コピー存在することを明らかにした。(2)メダカ属魚類のエンテロトキシン・グアニリン受容体型グアニル酸シクラーゼ遺伝子:ヒメダカにはエンテロトキシン・グアニリン受容体型グアニル酸シクラーゼとしてOlGC6が存在する。この遺伝子の約16kbpのゲノム構造の解析は完了しているが、純系メダカHdrRのゲノムDNAを用いたgenomic Southern解析では遺伝子は1コピーと判定される結果であったが、ヒメダカ1個体から得たゲノムDNAを用いたgenomic Southern解析では遺伝子は2コピーと判定される結果であった。さらにOlGC6の5'上流領域にレポーター遺伝子を融合させ転写・発現活性を検討した結果、メダカ胚でも、ヒト腸由来の培養細胞(Caco-2 Cell)では転写活性を示したが、ミドリザル腎臓由来のCOS1細胞では転写活性を示さなかった。また、転写に必須な配列は転写開始点から200-300bp上流付近と50-100bp上流付近の2ヶ所あることが明らかになった。(3)メダカ属魚類の感覚器官特異的グアニル酸シクラーゼ遺伝子:ヒメダカ感覚器官特異的グアニル酸シクラーゼのうちOlGC3は網膜に、OlGC4は網膜、松果体及び嗅組織に、OlGC5は網膜に発現していることを明らかにした。また、純系メダカHdrRのゲノムDNAを用いたgenomic Southern解析ではOlGC4及びOlGC5は1コピーと判定される結果であったが、OlGC3は2コピーと判定される結果であった。OlGC3及びOlGC4の5'上流領域とレポーター遺伝子を用いた各種のdeletion constructsをヒメダカ胚に顕微注入して転写活性を測定した結果、OlGC3では転写開始点から約900bp付近、OlGC4では約2kbp付近に基本転写に必要な配列があることが明らかになった。(4)メダカ属可溶性グアニル酸シラーゼ遺伝子:ヒメダカの可溶性型グアニル酸シクラーゼの2つのサブユニット遺伝子はゲノム上986bpの介在配列を挟んでタンデムに配置されていることを明らかにした。COS1細胞を用いてプロモーター領域の解析を詳細に解析した結果、基本転写活性に必要な領域は転写開始点から50-100bp上流付近にあり、さらに上流にはエンハンサーとして働く領域の存在も明らかになった。

Research Products

• [Publications] T.Mantoku: "Sequence analysis of eDNA and genomic DNA, and mRNA expression of the medaka fish homolog of the mammalian guanylyl cyclase C"J. Biochem.. 125. 476-486 (1999)
• [Publications] K..Nomura: "The primary and higher order structures of sea urchin ovoperoxidase as determined by cDNA cloning and predicted by homology modeling"Arch. Biochem. Biophys.. 367. 173-184 (1999)
• [Publications] T.Mikami: "Tandem organization of medaka fish soluble guanylyl cyclase α_1 and β_1 subunit genes : Implications for co-ordinated transcription of two subunits genes"J. Biol. Chem.. 274. 18567-18573 (1999)
• [Publications] K.Suzuki: "Molecular phylogenetic analysis of diverse forms of echinoderm guanylyl cyclases"Zool. Sci.. 16. 515-527 (1999)
• [Publications] K.Takeda: "Genomic structure and expression of the medaka fish homo log of the mammalian guanylyl cyclase B"J. Biochem.. 126. 104-114 (1999)
• [Publications] R. Kusakabe: "Invivo analysis of two striated muscle actin promoters reveals combinations of multiple regulatory modules required for skeletal and muscle specific gene expression"Int. J. Dev. Biol.. 43. 541-554 (1999)
• [Publications] N.Suzuki: "The Male Gamete from Basic Science to Clinical Application"Cache River Press. 516 (1999)