メダカゲノムBACライブラリーの構築

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11236209
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 浅川 修一 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (30231872)
• Keywords: メダカゲノム / BAC / LG22 / 4次元PCR / 性決定 / GSS / BAC末端シーケンス / ポジショナルクローニング

Research Abstract

1 北日本由来近交系HNI株をソースとして、20ゲノム相当(平均インサートサイズ160kb、9万6千クローン)のBACライブラリーを作製し、384穴プレート250枚に個別に保存した。さらにコロニーハイブリダイゼーション法によって目的のクローンを同定するための高密度レプリカフィルターを多数作製した。
2 BACクローンの末端シーケンシングを推進するための実験系を確立し、HNI-BAC8,160クローンの両末端を解読した。また我々が名大堀教授らと共同で構築していたメダカHd-rR株BAC、ドイツで構築されたメダカCab株BACについてそれぞれ、11,904クローン、1,152クローンの両末端シーケンスを決定した。これらによって解読した計21,216クローンのBAC末端シーケンスをGSS(Genome survey sequence)としてデータベース化した。
3 メダカHd-rR株30,720クローンに対してPCRスクリーニングを行うためのBAC-DNAプールを調製した。このスクリーニング系では、1次スクリーニングとして20スーパープール、2次スクリーニングとして各スーパープールに対して28プールの4次元DNAミックスをテンプレートにPCRを行うようデザインした。これらはBACウォーキングなどに活用した。
4 領域内外の研究者と共同でメダカ22番染色体全体(約20Mb)のシーケンシングを目指して、BACコンティグの作成、シーケンシングを進めた。2004年2月現在で11Mb(55%)をカバーするBACのコンテイグ作成および7Mb(35%)のシーケンシングが完了した。
5 領域内外の研究者に多数のBACクローンやそのスクリーニング材料、末端シーケンスデータを提供した。その結果、メダカ性決定遺伝子など様々な遺伝子のポジショナルクローニングや構造解析、さらにBACコンティグマップや連鎖地図作成に貢献した。

Research Products

• [Publications] Yao Y, Yamamoto, T., Tsutsumi, M., Matsuda, M., Hori, H., Naruse, K., Mitani, H., Shima, A., Asakawa, S., Shimizu, N., Suzuki, N.: "Genomic structure and expression of the soluble guanylyl cyclase alpha2 subunit gene in the medaka fish Oryzias latipes."Zoolog Sci.. 20. 1293-1304 (2003)
• [Publications] Okubo, K., Ishii, S., Ishida, J., Mitani, H., Naruse, K., Kondo, M., Shima, A., Tanaka, M., Asakawa, S., Shimizu, N., Aida, K.: "A novel third gonadotropin-releasing hormone receptor in the medaka Oryzias latipes : evolutionary and functional implications."Gene.. 314. 121-131 (2003)
• [Publications] Kondo, M., Nanda, I., Hornung, U., Asakawa, S., Shimizu, N., Mitani, H., Schmid, M., Shima, A., Schartl, M.: "Absence of the candidate male sex-determining gene dmrt1b(Y) of medaka from other fish species."Curr Biol.. 13. 416-420 (2003)