2002 Fiscal Year Annual Research Report
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11237205
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| Research Institution | Osaka Bioscience Institute |
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Principal Investigator |
内匠 透 (財)大阪バイオサイエンス研究所, 第3研究部, 研究室長 (00222092)
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| Keywords | 遺伝子 / 神経科学 / 生理学 / 脳・神経 |
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| Research Abstract |
哺乳類時計遺伝子のin vivoにおける機能解析
ショウジョウバエリズム変異体(per0)にショウジョウバエdtimプロモータ支配下のマウスmPer1,mPer2を導入したトランスジェニックショウジョウバエの行動解析をした結果、行動リズムが回復するものがみられ、哺乳類mPer1,mPer2がショウジョウバエ生体の中で時計機能を有することを証明した。
時計蛋白CRY1,CRY2の核移行の分子メカニズム
培養細胞を用いた実験等から、CRYとPERとの核移行が、転写のフィードバック機構の本体を調節し、時間の決定機構となるという仮説をたて、時計分子の核移行の詳細な分子機構を検討した。CRY2には典型的な核移行シグナルNLSがカルボキシル端側に存在するが、CRY1には定型的NLSが存在しない。CRY1,CRY2をタグ付きGST融合蛋白として大腸菌にて発現、精製した蛋白をNIH3T3培養細胞に注入することによりその核移行を検討した。CRY1,CRY2蛋白の細胞質内注入後、両者とも核内への移行がみられたが、WGA, Ran-GTP, G19V Ran-GTP等との共注入実験を行った所、同じく両者ともRan依存性に核移行することが明らかになった。さらに、CRY1,CRY2をそれぞれN末側C末側に二分割したCRY1N, CRY1C, CRY2N, CRY2Cを、同様に大腸菌を用いて蛋白を発現、精製し、細胞注入した結果、いずれもN末端側蛋白(CRY1N, CRY2N)は核移行を示さず、C端側(CRY1C, CRY2C)は核移行を観察した。セミインタクト細胞を用いたin vitro系では、CRY1C, CRY2Cともにimportinαβを介する核移行を行っていることが示された。NLS配列をもつCRY2Cの核移行はin vitro結合実験の結果からもimportinαβを介する核移行であることを明らかにした。
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[Publications] Y.Shigeyoshi, E.Meyer-Bernstein, K.Yagita, W.Fu, Y.Chen, T.Takumi, P.Schotland, A.Sehgal, H.Okamura: "Restoration of circadian behavioural rhythms in a period null Drosophila mutant(per01) by mammalian period homologues mPer1 and mPer2"Genes Cells. 7・2. 163-171 (2002)
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[Publications] S.Bouret, V.Prevot, T.Takumi, JC.Beauvillain, V.Mitchell: "Regulation by gonadal steroids of the mRNA encoding for a type I receptor for TGF-beta in the female rat hypothalamus"Neuroendocrinology. 76・1. 1-7 (2002)
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[Publications] T.Takumi: "Rapid cDNA cloning by PCR screening(RC-PCR)"Methods Mol Biol. 192. 385-389 (2002)
