ADAMファミリーメンバーのクローニングと機能解析

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11240205
• Research Institution: Beppu University
• Principal Investigator: 山本 俊輔 別府大学, 食物栄養学部, 教授 (90040188)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松浦 恵子 大分大学, 医学部, 助手 (00291542)
• Keywords: ADAM15 / バリアント蛋白 / Lck / Hck / Src / T細胞活性化 / ADAM6 / shedding

Research Abstract

ADAM15:ヒトADAM15のバリアント:細胞内ドメインに25個とそれに続く24個計49個のアミノ酸の挿入配列を持つADAM15v1とADAM15v2を見出した。この細胞内配列はプロリンに富むクラスIIおよびクラスIのSH3結合配列から成り、ADAM12の細胞内ドメインのそれに酷似するが、ADAM15v2はこの配列をタンデムに持つことからより強力な構造である。このバリアントmRNAはT細胞およびマクロファージに強く発現している。ADAM15v2のSH3結合配列に対する単クローン抗体(mAb)を作成し、免疫沈降法でバリアント蛋白の発現を確認した。マウスのADAM15遺伝子の全塩基配列を決定し、イントロン19内に同様のバリアントが存在することを確認した。マウスのADAM15v2は24個のSH3結合配列はクラスIIの1個のコンセンサス配列の違いから、クラスIのみの配列である。ヒトおよびマウスのADAM15v2とSrcファミリー蛋白との結合性や結合度をADAM15のそれと比較検討するために、Lck、Hck-GST蛋白、非燐酸化および燐酸化ADAM15およびADAM15v2HIS蛋白を作成しプルダウン法および免疫沈降法でADAM15v2がより強く、また、燐酸化蛋白がより強く反応することを確認した。さらに、非燐酸化および燐酸化ADAM15およびADAM15v2GST蛋白を作成し,抗LckあるいはHck抗体を用いてJurkat細胞やHL60細胞のLckあるいはHckが燐酸化ADAM15v2により強く反応することを確認した。また、マウスのEL4細胞では類似の方法で燐酸化LckおよびSrcが強く反応することを確認した。また、JurkatやEL4細胞をミリスチン酸や抗CD3抗体刺激で燐酸化ADAM15v2により強く反応することを観察した。Jurkat細胞では抗CD3抗体刺激でLFA-1とICAM-1の結合が亢進するが、この反応がBioporterを用いた抗ADAM15v2mAbの細胞内注入により阻害されることを確認した。(2)ADAM8(CD156):ADAM8のstabl transfectantを293T細胞に作成し、これに、TNF-α,HB-EGF,L-selectin,FasL,CD44などをtransient transfectし、免疫沈降法でTNF-αおよびHB-EGFが遊離されること(shedding)を確認した。TNF-αでは遊離をELISA法でも確認した。細胞内ドメインにはクラスIIおよびクラスI配列が存在し、これらにHckやLckが強く反応することを観察した。

Research Products

• [Publications] Higuchi, Y.: "CD156 transgenic mice : different responses between inflammatory types"Pathobiology. 7・1. 47-54 (2002)
• [Publications] Shimizu, E: "Structure and expression of the murine ADAM 15 gene and its splice variants"Biochim.Biophys.Res.Commun.. 309・4. 779-785 (2003)
• [Publications] Yasui, A.: "Expression of splice variants of the human ADAM 15 gene, and strong interaction between the cytoplasmic domain"Pathobiology. (印刷中).
• [Publications] 山本俊輔: "ADAMファミリー蛋白"炎症と免疫. 11・4. 516-518 (2003)
• [Publications] Yasui, A.: "Leukocyte Typing VII White Cell Differentiation Antigens"Oxford University Press. 366-367 (2002)