2001 Fiscal Year Annual Research Report
Mcm蛋白質ならびにMcmと相互作用する蛋白質複合体による複製モニター機構
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11241201
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
升方 久夫 大阪大学, 大学院・理学研究科, 教授 (00199689)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石見 幸男 三菱化学生命科学研究所, 主任研究員
滝澤 温彦 大阪大学, 大学院・理学研究科, 教授 (60154944)
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| Keywords | 複製開始前複合体 / リン酸化 / 複製開始点認識複合体 / チェックポイント / 細胞周期 / DNAヘリカーゼ |
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| Research Abstract |
1.複製開始モニター機構に関与するMCMの機能制御について以下の知見を得た。
(1)MCMは分裂酵母染色体複製開始点内でORCとは離れた部位に結合することを示した。この部位は複製開始部位とほほ同一であり、MCM機能がDNA合成開始に直結することが示唆された。
(2)分裂酵母でMcm4/6/7複合体を大量・迅速に発現・精製する系を構築し、DNAヘリカーゼ活性を検出した。立体構造・機能解析に有用である。
(3)マウスMcm4のN末領域Thr19リン酸化認識抗体を用い、Thr19が細胞内でCdk2キナーゼ依存的にリン酸化されることを示した。
(4)ヒトHeLa細胞破砕液から精製したクロマチン結合型Mcm4/6/7複合体は、ヘリカーゼ活性を示さずMcm4リン酸化の増加がみられた。リン酸化によるMCM複合体の不活性化と解釈される。
(5)ツメガエルクロマチン結合型MCM6量体はCdc45依存的にATPase、DNAヘリカーゼ活性を示した。
2.MCM, Cdc45と相互作用するSld3の機能について以下の知見を得た。
(1)分裂酵母Sld3はDbf4-依存キナーゼ(DDK)に依存して複製開始点に結合し、Cdc45のクロマチン結合に必要である。
(2)Sld3は複製フォーク停止時でのCdc45のクロマチン結合維持に必要である。
(3)S期停止細胞で、Sld3はCheckpoint Rads因子やCds1に依存してリン酸化された。Sld3がチェックポイント制御の標的であり複製フォークの安定化や後期複製開始点の不活化に関与する可能性が示唆された。
(4)ツメガエル卵抽出液から特異的抗体でのSld5除去によりPsf1も同時に除かれ、複製活性が低下した。ツメガエルSld5-Psf1は出芽酵母と同様に複製開始に必須の因子であり、そのクロマチン結合はCDKよって制御されていることを示した。
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[Publications] Y.Okuno: "Clustered adenine/thymine stretches are essential for the function of a fission yeast replication origin"Mol.Cell.Biol.. 19・10. 6699-6709 (1999)
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[Publications] Masai, H.: "Human Cdc7-related kinase complex. In vitro phosphorylation of MCM by concerted actions of Cdks and Cdc7 and that of a critical threonine residue of Cdc7"J.Mol.Biol.. 275. 29042-29052 (2000)
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[Publications] Sato, M.: "Electron microscopic observation and single-stranded DNA binding activity of Mcm4,6,7 complex"J.Mol.Biol.. 300. 421-431 (2000)
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[Publications] Mimura, S.: "Central role for Cdc45 in establishing an initiation complex of DNA replication in Xenopus egg extracts"Genes Cells. 5. 439-452 (2000)
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[Publications] Takisawa, H.: "Eukaryotic DNA replication : from pre-replication complex to initiation complex"Curr.Opin.Cell Biol.. 12. 690-696 (2000)
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[Publications] Waga, S.: "DNA polymerasee is required for coordinated and efficient chromosomal DNA replication in Xenopus egg extracts"Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 98. 4978-4983 (2001)
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[Publications] Gotoh, T.: "Inactivation of the checkpoint kinase Cds1 is dependent on cyclin B-Cdc2 kinase activation at the meiotic G2/M-phase transition in Xenopus oocytes"J.Cell Sci.. 114. 3397-3406 (2001)
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[Publications] Takahashi, T.: "Interaction of fission yeast ORC with essential adenine/thymine stretches in replication origins"Genes to Cells. 6. 837-849 (2001)
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[Publications] Ishimi, Y.: "Phosphorylation of Mcm4 at specific sites by cyclin-dependent kinase leads to loss of Mcm4,6,7helicase activity. J. Biol. Chem."J.Biol.Chem.. 276. 34428-34433 (2001)
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[Publications] Tada, S.: "Molecular cloning of a cDNA encoding mouse DNA helicase B, which has homology to Escherichia coli RecD protein, and identification of a mutation in the DNA helicase B from tsFT848 temperature-sensitive DNA replication mutant cells"Nucleic Acids Res.. 29. 3835-3840 (2001)
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