Mcm蛋白質ならびにMcmと相互作用する蛋白質複合体による複製モニター機構

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11241201
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 升方 久夫 大阪大学, 大学院・理学研究科, 教授 (00199689)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石見 幸男 三菱化学生命科学研究所, 主任研究員 ; 滝澤 温彦 大阪大学, 大学院・理学研究科, 教授 (60154944)
• Keywords: 複製開始前複合体 / リン酸化 / 複製開始点認識 / チェックポイント制御 / 細胞周期制御 / DNAヘリカーゼ

Research Abstract

1.複製開始モニター機構で中心的役割を果たすMCM複合体の活性制御について以下のことを明らかにした。
(1)分裂酵母複製開始点ではMCMの結合部位がORC結合部位と異なることを明らかにした。
(2)MCMの結合に特異的に働く領域を見いだした。
(3)アフリカツメガエルMCM複合体が染色体結合後、S期CDKおよびCdc45に依存してより強固な複合体に変化し、抗体により精製した複合体にはDNAヘリカーゼ活性があることを明らかにした。
(4)ヒトMcm4のリン酸化特異的抗体を用いて、アミノ酸番号7,19,32,110番のSer, ThrのG2/M期でのリン酸化がCdc2キナーゼによることを明らかにした。これらのリン酸化は再複製阻止に重要な役割を果たす可能性がある。
(5)ヒト培養細胞でヒドロキシ尿素(HU)添加により複製が阻害されチェックポイント機構が働く条件で、Chk1に依存してMcm4のCDKリン酸部位が高度にリン酸化されることを見いだした。
2.MCM複合体と相互作用し、複製制御に働く因子について以下のことを明らかにした。
(1)分裂酵母Sld3を同定し、Sld3はG1期にCdc7-Dbf4キナーゼに依存して複製開始点に結合し、Cdc45の複製開始点結合に必須であることを明らかにした。
(2)Mcm5変異の解析から、Sld3,DNAポリメラーゼeはCdc45に依存せずに複製開始点に結合することを明らかにした。
(3)アフリカツメガエルCut5/Dpb11ホモログを同定し、カエル卵抽出液の系を用いてCut5/Dpb11が複製開始に必要であり、S期CDKおよびCdc45の上流で働くことを明らかにした。
(4)荒木ら(遺伝研)との共同研究により、真核生物の染色体複製開始に必須な新規因子GINS複合体をカエル卵の系を用いて明らかにした。GINS複合体はSld5/Psf1/Psf2/Psf3(go-ichi-ni-san)の四種類のサブユニットから構成され、Cdc45と相互依存的に染色体に結合することで、複製開始複合体形成に働くことを明らかにした。

Research Products

• [Publications] Nakajima, R.: "SpSld3 is required for loading and maintenance of SpCdc45 on chromatin in DNA replication in fission yeast"Mol. Biol. Cell.. 13. 1462-1472 (2002)
• [Publications] You, Z.: "Roles of Mcm7 and Mcm4 subunits in the DNA helicase activity of the mouse Mcm4/6/7 complex"J. Biol. Chem.. 277. 42471-42479 (2002)
• [Publications] Fujita, M.: "Nuclear organization of DNA replication initiation proteins in mammalian cells"J. Biol. Chem.. 277. 10354-10361 (2002)
• [Publications] Takahashi, T.: "Multiple ORC-binding sites are required for efficient MCM loading and origin firing in fission yeast"EMBO J.. 22. 964-974 (2003)
• [Publications] Masuda, T.: "CDK-and Cdc45-dependent priming of the MCM complex on chiomatin during S-phase in Xenopus egg extracts"Genes Cells. 8. 145-161 (2003)
• [Publications] Kubota, Y.: "A novel ring-like complex of Xenopus proteins essential for the initiation of DNA replication"Genes Dev.. (in press). (2003)
• [Publications] Ishimi, Y.: "Enhanced expression of Mcm proteins in cancer cells derived from uterine cervix"Eur. J. Biochem.. (in press). (2003)
• [Publications] Ishimi, Y.: "Regulation of eukaryotic DNA replication and the role of Mcm helicase"Recent Res. Devel. Mcl. Cell. Biol.. 3. 47-57 (2002)
• [Publications] Kubota, Y.: "Block to DNA replication in meiotic maturation"Bio Essays.. (in press). (2003)
• [Publications] Yabuta, N.: "Mamalian Mcm2/4/6/7 complex forms a toroidal structure"Genes Cells.. (in press). (2003)
• [Publications] Masukata, H.: "Condensations and commentaries on "S-Cdk-dependent phosphorylation of Sld2 essential for chromosomal DNA replication in budding yeast""Chemtracts, Biochemistry and Molecular Biology. 15. 513-519 (2002)
• [Publications] Ishimi, Y.: "Condensations and commentaries on "Cyclin-dependent kinases prevent DNA replication through multiple mechanisms""Chemtracts, Biochemistry and Molecular Biology. 15. 565-571 (2002)
• [Publications] 升方久夫: "「ゲノムの複製と分配」松影昭夫、正井久雄編"シュプリンガーフェアラーク東京. 40-49/234 (2002)
• [Publications] 石見幸男: "「ゲノムの複製と分配」松影昭夫、正井久雄編"シュプリンガーフェアラーク東京. 87-92/234 (2002)