2001 Fiscal Year Annual Research Report
複製開始と細胞周期を制御する染色体複製装置の構造と機能
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11241204
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
片山 勉 九州大学, 薬学研究院, 助教授 (70264059)
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| Keywords | DNA複製 / 細胞周期 / DNAポリメラーゼ / DnaAタンパク質 / ATP / AAAファミリー / 染色体複製開始制御 / 大腸菌 |
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| Research Abstract |
当初申請時においては、in vitroの実験系を用いて、DnaAに結合したATPの水解を進める因子としてDNAポリメラーゼIII(大腸菌の染色体レプリカーゼ)のDNA結合型スライディングクランプが必要であることを明らかにしていた。さらに、未知因子(ldaB)を含むin vitroミニ染色体複製系において、DnaA結合性ATPがDNA複製と共役して水解されADP型DnaAが生じることも見出していた(Cell,1998)。これは複製開始後に、DnaA蛋白質が、DNA上にロードされたDNAポリメラーゼーIIIスライディングクランプによって直接、不活性化されうることを意味している。その後、DnaA免疫沈降法を改良してin vivoのDnaAのヌクレオチド結合型を初めて検出・定量した。これにより、細胞内のDnaA結合性ATPが染色体複製依存的に水解されADP型DnaAが生じること、また、DnaAのヌクレオチド結合型は複製サイクルと同調して変動し複製開始期には一時的に上昇することなどを解明し論文を発表した(EMBOJ.,1999)。これはin vitro解析で得た結論と大変良く一致するものである。また、RIDAによるDnaA結合性ATPの加水分解機構についても解析を進め、ATP水解に必要なアミノ酸残基を同定した(Mol.Microbiol.,2001)。この残基はいわゆるAAA^+蛋白質ファミリー特有のモチーフに属していた。平行して、未知因子ldaBの実体が新規な蛋白質Hdaであることを同定した。in vivo, in vitroで機能解析した結果、Hda蛋白質がRIDA反応に直接参加する必須因子であることを確証したのである(EMBOJ.,2001)。DnaA同様、Hda蛋白質もAAA^+蛋白質ファミリーに属しているので、複合体形成によりATP水解能を活性化するというこのファミリーの特徴から、RIDAの分子機構にも同様なステップがあると現在考えている。
加えて、申請者は、細胞粗抽出液中にRDA特異的な阻害因子の存在を見出した。細胞周期に依存して、複製開始時期特異的にRDAを阻害し、活性型のDnaAを保持するシステムがあるかも知れない。
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[Publications] Nishida, S., Fujimitsu, K., Sekimizu, K., Ohmura, T., Ueda, T., Katayama, T.: "A nucleotide switch in E. coli DnaA protein initiates the chromosomal replication : Evidence from a mutant DnaA protein defective in regulatory ATP hydrolysis in vitro and in vivo"Journal of Biological Chemistry. (印刷中). (2002)
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[Publications] Onogi, T., Ohsumi, K., Katayama, T., Hiraga, S.: "Replication-dependent recruitment of the βsubunit of DNA polymerase III from cytsolic spaces to replication forks in Escherichia coli"Journal of Bacteriology. 183・4. 867-870 (2002)
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[Publications] Kubota, T., Ito, Y., Sekimizu, K., Tagaya, M., Katayama, T.: "DnaA protein Lys-415 is close to the ATP-binding site : ATP-pyridoxal affinity labeling"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 288・5. 1141-1148 (2001)
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[Publications] Kawakami, H., Iwura, T., Takata, M., Sekimizu, K., Hiraga, S., Katayama, T.: "Arrest of cell division and nucleoid partition by genetic alterations in the sliding clamp of the replicase and DnaA protein"Mol. Genet. Genomics. 266. 167-179 (2001)
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[Publications] Kato, J., Katayama, T.: "Hda, a novel DnaA-related protein, regulates the replication cycle in Escherichia coli"EMBO Journal. 20・15. 4253-4262 (2001)
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[Publications] Su'etsugu, M., Kawakami, H., Kurokawa, K., Kubota, T., Takata, M., Katayama, T.: "DNA replication-coupled inactivation of DnaA protein in vitro : a role for DnaA arginine-334 of the AAA^+ Box VIII motif in ATP hydrolysis"Molecular Microbiology. 40・2. 376-386 (2001)
