DNA・タンパク質相互作用の1分子イメージングと計測

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11242204
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (B)
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 原田 慶恵 慶応義塾大学, 理工学部, 講師 (10202269)
• Keywords: DNA / タンパク質 / RNAポリメラーゼ / イメージング / 顕微鏡 / 転写

Research Abstract

DNAと相互作用するタンパク質として、大腸菌からRNAポリメラーゼを調製した。調製後のRNAポリメラーゼの活性測定を行い、正常な活性を有していることを確認した。次に顕微鏡システムのセットアップを行った。DNAは非常に強力なA1プロモーターが1つ存在する欠失突然変異T7ファージを鋳型に、合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてA1プロモーターを含む長さ2マイクロメーター程度のDNAをPCR法で調製した。その際、片方のプライマーとするオリゴヌクレオチドをビオチン化しておきDNAの片端をビオチン化した。合成したDNAとRNAポリメラーゼをATP, GTP, CTP, ApU 存在下で30度、3分程度処理するとRNAポリメラーゼはA1プロモーター部位から転写を開始し、20番目のAのところで転写を休止し、いわゆるstalled complex を形成することを確認した。この転写複合体をガラス基板上に固定しDNAの片端にストレプトアビジンビーズを結合させ、NTPを加えビーズのブラウン運動を観察した。はじめビーズは激しくブラウン運動しているが、転写が進むにつれて、DNAがRNAポリメラーゼにたぐり寄せられていき、ビーズのブラウン運動がしだいに小さくなり、最後にはDNAが完全にたぐり寄せられてしまい。ビーズのブラウン運動が停止するのが観察できた。ブラウン運動停止までの時間とDNAの長さからRNAポリメラーゼの転写活性を見積もることができた。

Research Products

• [Publications] Yasuharu Arai: "Tying a moecular knot with optical tweezers"Nature. 399. 446-448 (1999)
• [Publications] 原田 慶恵: "エバネッセント波を用いたDNA-RNAポリメラーゼ1分子相互作用のイメージング"精密工学会誌. 65. 205-208 (1999)
• [Publications] 原田 慶恵: "分子のひもを結ぶ"三田評論. 1015. 68-69 (1999)
• [Publications] 原田 慶恵: "DNA分子に結び目をつくる"遺伝. 53. 10-12 (1999)