分子間相互作用の可視化と細胞内分子定量イメージング

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11242206
• Research Institution: National Institute of Genetics
• Principal Investigator: 徳永 万喜洋 国立遺伝学研究所, 構造遺伝学研究センター, 教授 (00192659)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 椎名 伸之 国立遺伝学研究所, 構造遺伝学研究センター, 助手 (30332175) ; 安永 卓生 九州工業大学, 情報工学部, 助教授 (60251394) ; 後藤 由季子 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 助教授 (70252525)
• Keywords: 1分子イメージング / 1分子ナノテクノロジー / 薄層斜光照明法 / 蛍光顕微鏡 / 細胞質核間分子輸送 / 定量的画像解析 / 分子機構定量解析

Research Abstract

細胞内で蛍光1分子イメージングを可能にする新しい顕微鏡法として、薄層斜光照明法を用いた1分子イメージング法を開発した。簡単な原理ではあるが、従来にない新しいものであり、細胞内部におけるイメージングで、2点識別分解能70nm(通常の約3倍の高分解能)を画像解析により達成した。また、生きている細胞において、長時間観察を可能にする方法としても期待される。
薄層斜光照明法を用いて、細胞質-核間で輸送される分子をGFPで蛍光標識し細胞内で観察したところ、分子1個の蛍光像が核膜上で観察された。蛍光像が光っている時間から、核膜孔上での通過時間が、約3秒であることがわかった。
蛍光ラベルした分子濃度を増やすと、核膜孔の点像からなる蛍光像が得られた。1分子と核膜孔1個との蛍光強度の比から、1つの核膜孔に結合している分子数を定量した。濃度を変えて定量的画像解析を行うことにより、核膜孔との結合分子数・結合定数といった、分子機構上重要な量を定量的に求めることができた。その結果、核膜孔には弱い結合部位と強い結合部位があることが見つかった。弱い結合部位は最大約100個の分子を結合させて分子を集める役割を果たし、約8個の分子を結合できる強い部位もしくはその近傍で、Gタンパク質との反応がおこって核内に荷物を降ろすという、分子機構を提案した。
このように、1分子イメージング法は、従来求められなかった細胞内での諸量を定量的に求め、分子機構を解明する新しい手法として有用であることを、始めて示すことができた。

Research Products

• [Publications] Hirakawa, Y.: "Analysis of the Nano-Kinetic Movement of a Single DNA by a Pin-Fiber Video Scope"Analytical Sciences. 18. 1293-1294 (2002)
• [Publications] Fkuzawa A.: "Single Molecule Measurement of Elasticity of Serine-Glutamate-and Lysine-Rich Repeats of Invertebrate Connectin Reveals That Its Elasticity Is Caused Entropically by Random Coil Structure"J.Mus.Res.Cell Mot.. (in press).
• [Publications] 徳永 万喜洋: "「見えなかったものを観る-無理と言われたテーマに挑戦-」"ロマン探究""Science & Technorogy Journal. 11・10. 52-53 (2002)
• [Publications] Ogawara, Y: "Akt enhances Mdm2-mediated ubiquitination and degradation of p53"J.Biol.Chem.. 277. 21843-21850 (2002)
• [Publications] Tsuruta, F.: "The PI3K-Akt pathway suppresses Bax translocation to mitochondria"J.Biol.Chem.. 277. 14040-14047 (2002)
• [Publications] Shinohara, M: "SWAP-70 is a guanine nucleotide exchange factor that mediates signaling of membrane ruffling"Nature. 416. 759-763 (2002)
• [Publications] Yoshida, T.: "Archaeal Group II Chaperonin Mediates Protein Folding in the cis-Cavity Without a Detachable GroES-like Co-chaperonin"J.Mol.Biol. 315(1). 73-85 (2002)
• [Publications] 徳永 万喜洋: "実験医学別冊"バイオイメージングでここまで理解(わか)る""表面のみを高画質に観察できる全反射蛍光顕微鏡法. 104-113 (2002)
• [Publications] 徳永 万喜洋: "生物物理ハンドブック"アクチン・ミオシン分子モーター系(印刷中).
• [Publications] 安永 卓生: "機器分析"透過型電子顕微鏡法. 247-260 (2002)
• [Publications] 安永 卓生: "これからの大学等研究施設 生命科学編"電子顕微鏡とその施設. 8-3-8-6 (2002)
• [Publications] 安永 卓生: "「第6回シミュレーション・サイエンス・シンポジウム」及び核融合科学研究所共同研究「大型シミュレーション研究」合同研究会集録集"分子動力学を用いた、電子顕微鏡三次元像からの原子モデル構築へ向けて(印刷中).