cameleon1分子イメージングによる局所的カルシウム動態の解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11242208
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 宮脇 敦史 理化学研究所, 細胞機能探索技術開発チーム, チームリーダー(研究職) (80251445)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 永井 健治 理化学研究所, 細胞機能探索技術開発チーム, 研究員 (20311350) ; 濱 裕 理化学研究所, 細胞機能探索技術開発チーム, 研究員 (30261796) ; 水野 秀昭 理化学研究所, 細胞機能探索技術開発チーム, 研究員 (80301779)
• Keywords: GFP / YFP / 発色団 / cameleon / カルシウム / イメージング / 落射蛍光顕微鏡 / pericam

Research Abstract

1,オワンクラゲ由来の改変GFP(green fluorescent protein)の発色団形成効率を飛躍的に向上させることで、新規YFP(yellow fluorescent protein)であるVenusを作製した。Venusは、周囲の環境変化に対する抵抗性も改善してあり、これを用いることにより事実上最も迅速で効率の高い蛍光ラベリングが可能になった。Venusを組み込んだcameleonを用いることで、たとえば新鮮なacute brain sliceにおけるcalcium imagingが達成できた。
2,オワンクラゲやその他の動物種に由来する蛍光タンパク質の色は非常に多彩である。それらを使い熱して、複数の細胞内事象を同時に観察するためのマルチカラーイメージング落射蛍光顕微鏡システムを開発した。non-reflectiveなreflectorを用いることにより高速な照明および観察光学系の波長切り替えが可能になり、calciumの下流の多様な事象を紐解く実験に応用できることを示した。
3,オワンクラゲ由来のGFPの蛍光特性を活用すると様々な2波長励起1波長測光型の蛍光指示薬が作製できる。このイメーンジングがレーザー走査型共焦点顕微鏡でできるような光学システムを構築し、ratiometric-pericamを使ったカルシウム濃度の断層像を取得することに成功した。

Research Products

• [Publications] Nagai T., Ibata K., Park E.S., Kubota M., Mikoshiba K., Miyawaki A: "A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications"Nature Biotechnology. 20. 87-90 (2002)
• [Publications] Sawano A., Hama H., Saito N., Miyawaki A.: "Multi-color imaging of Ca^<2+> and protein kinase C signals using novel epi-fluorescence microscopy"Biophysical Journal. 82. 1076-1085 (2002)
• [Publications] Miyawaki A., Mizuno H., Nagai T., Sawano A.: "Development of genetically-encoded fluorescent indicators for calcium"Methods in Enzymology. (2002)
• [Publications] Shimozono S., Fukano T., Nagai T., Kirino Y., Mizuno H., Miyawaki A.: "Confocal imaging of subcellular Ca^<2+> concentrations using a dual excitation ratiometric indicator based on green fluorescent protein"Science STKE. (2002)
• [Publications] Mochizuki N., Yamashita S., Kurokawa K., Ohba Y., Nagai T., Miyawaki A., Matsuda: "Spatio-temporal images of growth-factor-induced activation of Ras and Rap1"Nature. 411(6841). 1065-1068 (2001)
• [Publications] Kurokawa K., Mochizuki N., Ohba Y., Mizuno H., Miyawaki A., Matsuda M.: "A pair of FRET-based probes for tyrosine phosphorylation of the CrkII adaptor protein in Vivo"J Biol Chem. 276(33). 31305-31310 (2001)