低分子量G蛋白が細胞膜で情報を受け取るメカニズムの可視化

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11242209
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 松田 道行 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (10199812)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 黒川 量雄 大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (40333504) ; 大場 雄介 大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (30333503)
• Keywords: Ras / FRET / Rap1 / G蛋白 / 低分子量G蛋白 / イメージング

Research Abstract

昨年度までに作成したRasファミリーG蛋白の生細胞における活性化モニターを使って、詳細な解析を行った。すなわち上皮細胞増殖因子(EGF)により細胞を刺激した時にRasが細胞膜で、Rap1がエンドメンブレンで活性が上昇する機構を解析した。まず、Rap1の活性化にはエンドサイトーシスが必要であることをモノダンシルガダベリンを用いて明らかにした。次に、cAMPで刺激したところ、やはり、細胞の内部でのみRap1の活性化が見られた。cAMPはEpacを介してRap1を活性化する。Epacの分布は細胞内でほぼ均一なので、このような不均一なRap1の活性化は、活性化因子によるよりは、不活性化因子の分布が決定しているらしい。このことを確かめるために、cAMP依存性にRasを活性化する系を作成した。これはEpacのcAMP結合部位をRasGRFの制御領域と置き換えた蛋白eGRFを発現することにより達成した。eGRFはEpacと同様の分布をしているにもかかわらず、cAMP刺激では、RasはEGFで刺激した細胞と同様に、やはり細胞膜で活性化された。さらに、Ras活性化の画像を各ピクセルごとに解析することにより、細胞の局所における活性化因子ならびに不活性化因子の動態変化を解析した。その結果、予想通り、不活性化因子の活性は細胞の中心部で高く、細胞の辺縁部に行くに従って高くなった。一方、活性化因子は細胞全体でほぼ均一であり、刺激によってもほぼ均一に上昇することがわかった。この結果は、Rasの時空間制御において、活性化因子が時間を、不活性化因子が空間をもっぱら制御していることを示すものである。このように、生細胞における活性化モニターを用いることにより、これまで不可能であった様々な細胞内事象の解析が可能となることが示せた。

Research Products

• [Publications] Endo, A., K.Nagashima, H.Kurose, S.Mochizuki, M.Matsuda, N.Mochizuki: "Sphingosine 1-phosphate induces membrane ruffling and increases motility of human umbilical vein endothelial cells via vascular endothelial growth factor receptor and CrkII"J. Biol. Chem.. 277. 23747-23754 (2002)
• [Publications] Itoh, R.E., K.Kurokawa, Y.Ohba, H.Yoshizaki, M.Mochizuki, M.Matsuda: "Activation of Rac and Cdc42 video-imaged by FRET-based single-molecule probes in the membrane of living cells"Mol. Cell. Biol.. 22. 6582-6591 (2002)
• [Publications] Nagashima, K., A.Endo, H.Ogita, A.Kawana, A.Yamagishi, A.Kitakabe, M.Matsuda, N.Mochizuki: "Adaptor protein Crk is required for Ephrin-B1-induced membrane ruffling and focal complex assembly of human aortic endothelial cells"Mol. Biol. Cell. 13. 4231-4242 (2002)
• [Publications] Sakakibara, A., Y.Ohba, K.Kurokawa, M.Matsuda, S.Hattori: "Novel function of Chat in controlling cell adhesion via Cas-Crk-C3G-pathway-mediated Rap1 activation"J. Cell Sci.. 115. 4915-4924 (2002)
• [Publications] Sawano, A., S.Takayama, M.Matsuda, A.Miyawaki: "Lateral propagation of EGF signalling after local stimulation depends on receptor density"Dev. Cell. 3. 245-257 (2002)
• [Publications] Ohba, Y., K.Kurokawa, M.Matsuda: "Mechanism of the spatio-temporal regulation of Ras and Rap1"EMBO J.. (In press). (2003)