プローブ顕微鏡による機能蛋白質間相互作用の直接観察による視細胞情報変換機構の解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11304058
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 徳永 史生 大阪大学, 大学院・理学研究科, 教授 (80025452)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐々木 純 大阪大学, 大学院・理学研究科, 助手 (70314359) ; 久冨 修 大阪大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (60231544)
• Keywords: 視覚 / 網膜 / 視細胞 / 原子間力顕微鏡 / ロドプシン / 機能性蛋白質 / 情報変換 / 光信号変換

Research Abstract

視細胞では光信号を膜電位変化という電気信号に変換している。光を吸収した視物質が、トランスデューシン、ホスホジエステラーゼを活性化し、環状グアノシン-燐酸(cGMP)の加水分解を促進し、cGMP依存Naチャンネルを閉じる。これが視興奮である。グアニル酸シクラーゼ、ロドプシンリン酸化酵素、アレスチン、Sモジュリン、ホスデューシン、グアニル酸シクラーゼ活性化タンパク質などが関係しており、光信号に対し最もよく電気信号が出るように制御している。本研究では、それらの分子の状態とそれらが相互作用したときの状態を直接観察し、解析しようとした。原子間力顕微鏡の分解能は理論的にはサブオングストロームであるが、しかし実質分解能を上げるのにカンチレバーの工夫や試料の工夫が必要であった。この工夫は以後も続けて行う計画である。ウシ眼球から調製したロドプシンに対する単クローン抗体を作成し、そのうちのロドプシンとそれに光照射したときに反応性の変わるものを分離した。その1つのエピトープがArg21からGlu25を含む領域にあることを決定した。ザリガニの視細胞のラブドーム及びイモリの視細胞円板膜の白金レプリカを作成し、透過型電子顕微鏡で観察した。またそのレプリカを原子間力顕微鏡で観察した。グアニル酸シクラーゼ、ロドプシンリン酸化酵素、アレスチン、Sモジュリン、ホスデューシン、グアニル酸シクラーゼ活性化タンパク質のcDNAをクローン化した。それらのうち、アレスチン、Sモジュリン、ホスデューシン、グアニル酸シクラーゼ活性化タンパク質のcDNAを発現ベクターに組み込み、大腸菌などで発現させた。発現したものが生体中のものと同じ性質を示すことを確認した。バクテリロロドプシンとセンソリーロドプシンのキメラ蛋白質、及びそれにトランスデューサーを結合した蛋白質をハロバクテリアで発現させ、生成した蛋白質の構造を原子間力顕微鏡で観察した。

Research Products

• [Publications] H.Morimura, F.Gomi, O.Hisatomi, T.Fujikdo, F.Tokunaga, M.Tohyama, Y.Tano: "A S66R mutation in the RGR gene reduces production of the RGR protein in HEK293 cells"Invest. Ophtbalmol. Vis. Sci.. 42. 3519 (2001)
• [Publications] K.Takeshita, N.Hirota, Y.Imamoto, M.Kataoka, F.Tokunaga, M.Terazima: "The structural change and energy dynamics in the photocycle of photoactive yellow protein(PYP)"Anal. Sci.. 17. 320-322 (2001)
• [Publications] K.Nakamura, H.Funakoshi, K.Miyamoto, F.Tokunaga, T.Nakamura: "Molecular cloning and functional characterization of a human scavenger receptor with c-type lectin(SRCL), a novel member of a scavenger receptor family"Biochem. Biopbys. Res. Commun.. 280. 1028-1035 (2001)
• [Publications] T.Yoshikawa, T.Okano, O.Hisatomi, F.Tokunaga, T.Oishi, Y.Fukada: "Immunohistochemical localization of opsinand alpha-subunit of transducins in the pineal complex ann deep brain of the Japanese grass lizard, Takydromus tachydromoides"Zool. Sci.. 18. 325-330 (2001)
• [Publications] Y.Taniguchi, O.Hisatomi, M.Yoshida, F.Tokunaga: "Pinopsin expressed in the retinal photoreceptors of a diurnal gecko"FEBS Lett.. 496. 69-74 (2001)
• [Publications] M.Harigai, S.Yasuda, Y.Imamoto, K.Yoshihara, F.Tokunaga, M.Kataoka: "Amino acids in the N-terminal region regulate the photocycle of photoactive yellow protein"J. Biochem.. 130. 51-56 (2001)