2000 Fiscal Year Annual Research Report
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11307017
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
名和田 新 九州大学, 大学院・医学研究院, 教授 (10038820)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
後藤 公宣 九州大学, 医学部・附属病院, 助手 (90284512)
柳瀬 敏彦 九州大学, 大学院・医学研究院, 助教授 (30239818)
高柳 涼一 九州大学, 大学院・医学研究院, 教授 (30154917)
野村 政壽 九州大学, 医学部・附属病院, 助手 (30315080)
岡部 泰二郎 九州大学, 医学部・附属病院, 助手 (40264030)
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| Keywords | Yeast two-hybrid assay / AR AF-1 / GSTプルダウン / cDNA cloning |
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| Research Abstract |
我々はアンドロゲン受容体(AR)AF-1領域に結合するAR特異的転写共役因子のクローニングを試みている。平成11年度では、AR AF-1領域に、分子量約90kDaのタンパク質が結合し、正常AR遺伝子を有する完全型睾丸性女性化症患者ではこの結合が観察されないことを線維芽細胞のwhole cell lysateを用いたGSTプルダウン法で証明した。そこで、平成12年度では、酵母two hybrid assayを用いてこのタンパク質のcDNAクローニングを試みた。
まず、核抽出液を線維芽細胞より得、GSTプルダウン法によりこの90kDaのタンパク質が核タンパク質であることを確認した。正常ヒト線維芽細胞よりcDNAライブラリーを作製し、Clontech社のMatchmaker LexA Two-hybrid Systemを用いて、AR AF-1領域cDNAをbaitとしてtwo hybrid assayを施行した。1000000個のIndependent colonyをスクリーニングし、陽性クローンのcDNA断片を用いて再度ヒト線維芽細胞cDNAライブラリーをスクリーニングした結果、分子量102 kDaの既知のタンパク質をコードする完全長cDNAを得た。このタンパク質はレポーター実験で用量依存的にリガンド依存性AR活性、リガンド非依存性AR AF-1活性を3から5倍増強した。現在、エストロゲン受容体、グルココルチコイド受容体に対する影響を観察すると同時に、免疫共沈実験、GSTプルダウン法を用いて、このタンパク質のAR AF-1領域への結合を確認中である。
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[Publications] Adachi M. et al: "Androgen Insensitivity Syndrome as a Possible Coactivator Disease"The New England Journal of Medicine. 343・12. 856-862 (2000)
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[Publications] Oba K. et al: "Transcriptional Regulation of the Human FTZ-F1 Gene Encoding Ad4BP/SF-1"Journal of Biochemistry. 128・3. 517-528 (2000)
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[Publications] Yi-Ming Mu et al: "A Nuclear Receptor System Constituted by RAR and RXR Induces Aromatase Activity in MCF-7 Human Breast Cancer Cells"Molecular and Cellular Endocrinology. 166. 137-145 (2000)
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[Publications] 名和田新 他: "ホルモンと臨床 転写共役因子による転写制御のメカニズム(48・増刊号)"36-38 (2000)
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[Publications] 高柳涼一 他: "ホルモンと臨床 AR活性の細胞性御因子:ARの活性発現に必須のAF-1特異的共役因子の存在を示唆するアンドロゲン不応症(48・増刊号)"44-49 (2000)
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[Publications] 岡部泰二郎 他: "組織培養工学 ステロイドホルモンレセプターと疾患(26・13)"507-512 (2000)
