2000 Fiscal Year Annual Research Report
人工制限酵素の構築とニュー・バイオテクノロジーの創成
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11308023
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| Research Institution | the University of Tokyo |
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Principal Investigator |
小宮山 真 東京大学, 先端科学技術研究センター, 教授 (50133096)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
須磨岡 淳 東京大学, 大学院・工学系研究科, 助手 (10280934)
八代 盛夫 東京大学, 大学院・工学系研究科, 助教授 (30192785)
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| Keywords | 人工制限酵素 / DNA / セリウム / 加水分解 / アミン / ランタニド |
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| Research Abstract |
DNAは非常に安定であり,天然酵素を用いることなしでは,容易には切断されない(無触媒下でのDNAの半減期は2億年).これに対して我々は,Ce(IV)が有効であることを報告している(半減期4時間).しかし,生理条件下では,Ce(IV)が金属水酸化物ゲルを生成するため,その応用範囲が限られていた.Ce(IV)を人工制限酵素の活性部位として利用するためには,錯体化が必要不可欠である.
昨年度からの一連の研究により,Ce(IV)-EDTA触媒系がDNA切断に有効であることを見出している.本年度は,切断活性についてのより詳細な検討を行った.その結果,Ce(IV)-EDTAの活性は,基質DNAの長さに大きく依存することが明らかになった.すなわち,チミジリル(3'-5')チミジンなどの短いDNAに対しては全く活性を示さないが,DNAオリゴマーやプラスミドDNAに対しては,Ce(IV)水酸化物ゲルと同等の活性を示した.EDTAはCe(IV)イオンと強く錯生成することが報告されていることから,Ce(IV)-EDTAは,人工酵素の触媒部位の有力な候補であることが明らかとなった.
また,生体系への応用のためには,μMオーダー以下の触媒によりDNAが切断されることが必須である.しかし,μMオーダーのCe(IV)-EDTAのみを用いた場合には,触媒濃度が非常に低いために,ほとんどDNAは切断されなかった.しかし,種々の条件でこの反応を検討した結果,ここにオリゴアミン類を添加することにより,活性が飛躍的に向上することを見出した。例えば,1μMのCe(IV)-EDTAに,わずか数10μMのスペルミンを添加することにより,効率的なDNA切断が実現した.このCe(IV)-EDTA_+オリゴアミン系触媒は,「DNAの特定部位をオリゴアミン類によって活性化することでDNAを配列特異的に切断する」という新規なDNA加水分解触媒系として広範な応用が期待される.
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[Publications] N.Takeda et al.: "Kinetic and theoretical studies on the mechanism of alkaline hydrolysis of DNA."J.Org.Chem.. 65. 4391-4396 (2000)
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[Publications] T.Igawa et al.: "Improvement of efficiency of the Ce (IV)-induced DNA scission-Relationship between the kinetic parameters (k_<cat> and K_m) and the DNA structure-"Nucleic Acids,Symp Ser.. 42. 231-232 (2000)
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[Publications] T.Igawa et al.: "Kinetic studies on Ce (IV)-induced hydrolysis of single-stranded and double-stranded oligonucleotides."Nucleosides & Nucleotides. 19. 891-902 (2000)
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[Publications] A.Kuzuya et al.: "Sequence-selective RNA scission by non-covalent combination of acridine-tethered DNA and lanthanide (III) ion."Chem.Lett.. 2019-2020 (2000)
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[Publications] T.Igawa et al.: "Hydrolysis of oligonucleotides by homogeneous Ce (IV)-EDTA complex."Chem.Lett.. 356-357 (2000)
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[Publications] A.Kuzuya et al.: "Non-covalent ternary systems (DNA-acridine hybrid/DNA/lanthanide (III)) for efficient and site-selective RNA scission."Chem.Commun.. 2019-2020 (2000)
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[Publications] J.Sumaoka et al.: "Homogeneous Ce(IV) complexes for efficient hydrolysis of plasmid DNA."Chem.Lett.. 56-57 (2000)
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[Publications] J.Sumaoka et al.: "Cooperation of the Ce (IV)/EDTA complex and oligoamine for prompt scission of DNA."Chem.Lett.. 20-21 (2001)
