G蛋白質共役型レセプターの分子進化とG蛋白質サブタイプ認識機構

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11308027
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 七田 芳則 京都大学, 大学院・理学研究科, 教授 (60127090)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 寺北 明久 京都大学, 大学院・理学研究科, 助手 (30212062)
• Keywords: ロドプシン / G蛋白質共役型受容体 / 2次元結晶解析 / G蛋白質 / G蛋白質共役特異性 / キメラ変異体 / 生化学的手法 / 分子進化

Research Abstract

本年度の研究実施計画に基づき、以下の研究を行った。
1.前年度の研究により、ウシロドプシンの二次元結晶を再現性よく作製することができるようになった。そこで、本年度は結晶性を高めるために種々の結晶化条件を探索するとともに、酵素処理などの効果を検討した。しかし、この実験の途中で、3次元結晶を用いたロドプシンの立体構造が発表された。そこで、ロドプシンの活性中間体であるメタIIの結晶化とG蛋白質との複合体の結晶化を計画の中心にすえ、これらの結晶化の条件設定に努力している。
2.発色団のβ-イオノン環に光親和性ラベルを組み込んだレチナールアナログをもちいて、ロドプシンの光反応過程での発色団の動きを検討した。その結果、ロドプシンおよびバソロドプシンでは、β-イオノン環はヘリックス6に存在するTrp265の近くに位置するが、ルミロドプシン以降では大きく位置をかえ、ヘリックス4に存在するAla169の近くに移動することがわかった。ロドプシンの状態ではAla169は蛋白質内部ではなく膜外に位置している。したがって、ルミロドプシン以降の中間体では、ヘリックスの回転を伴う再配置が起こることが示唆された。
3.GPCRの間でG蛋白質を活性化するメカニズムに共通点があるかどうかを、ロドプシンをモデルGPCRとして検討した。そのため、ロドプシンのG蛋白質相互作用部位である細胞質第3ループをアセチルコリン受容体など他のGPCRの第3ループに置換したキメラ変異体を作製し、G蛋白質を活性化できるか調べた。その結果、作製した変異体は置換したGPCRがもつG蛋白質共役特異性を示すようになった。このことから、ロドプシンスーパーファミリーのGPCRにはG蛋白質を選択的に活性化する共通のメカニズムが存在することがわかった。

Research Products

• [Publications] H.Imai: "Difference in molecular structure of rod and cone visual pigments studied by Fourier transform infrared spectroscopy"Biochemistry. (in press). (2001)
• [Publications] H.Kandori: "Excited-state dynamics of rhodopsin probed by femtosecond fluorescence spectroscopy"Chem.Phys.Lett. (in press). (2001)
• [Publications] H.Kandori: "Tight Asp85-Thr89 association during the pump switch of bacteriorhodopsin"Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 98(4). 1571-1576 (2001)
• [Publications] T.Hirano: "Chloride effect on iodopsin studied by low-temperature visible and infrared spectroscopies"Biochemistry. 40(5). 1385-1392 (2001)
• [Publications] H.Kandori: "Direct observation of the bridged water stretching vibrations inside a protein"J.Am.Chem.Soc. 122. 11745-11746 (2000)
• [Publications] A.Terakita: "Highly conserved glutamic acid in the extracellular IV-V loop in rhodopsins acts as the counterion in retinochrome, a member of rhodopsin family"Proc.Natl.Acad.Sci.USA.. 97. 14263-14267 (2000)
• [Publications] T.Yamashita: "Distinct roles of the second and the third cytoplasmic loops of bovine rhodopsin in G protein activation"J.Biol.Chem.. 275. 34272-34279 (2000)
• [Publications] B.Borhan: "Movement of retinal along the visual transduction path"Science. 288. 2209-2212 (2000)
• [Publications] H.Kandori: "Local and distant protein structural changes on photoisomerization of the retinal in bacteriorhodopsin"Proc Natl.Acad.Sci USA.. 97. 4643-4648 (2000)
• [Publications] S.Nishimura: "Activation mechanisms of G protein by seven-transmembrane receptors : A view from rhodopsin studies"J.Indian Chem.Soc.. (in press). (2001)
• [Publications] H.Imai: "Methods Enzymol."Academic Press. 959 (2000)
• [Publications] Y.Shichida: "Methods Enzymol."Academic Press. 959 (2000)
• [Publications] 七田芳則: "生き物はどのように世界を見ているか"学会出版センター(印刷中).