1999 Fiscal Year Annual Research Report
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11440198
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
鈴木 晋一郎 大阪大学, 大学院・理学研究科, 教授 (70116052)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
片岡 邦重 大阪大学, 大学院・理学研究科, 教授 (40252712)
山口 和也 大阪大学, 大学院・理学研究科, 助手 (80252550)
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| Keywords | 脱窒菌 / 亜硝酸還元酸素 / 銅タンパク質 / タイプ1銅 / タイプ2銅 / 変異体 |
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| Research Abstract |
脱窒菌Alcaligenes xylosoxidans GIFU 1051からのタイプ1銅とタイプ2銅を含んだ亜硝酸還元酵素(AxgNIR)のタイプ2銅近傍の非配位アミノ酸残基His255とAsp98を他のアミノ酸残基に変換した変異体を用いて、これらの残基の触媒反応における役割について検討した。NO_2^<2->還元反応の至適pH、pH5.5におけるAsp98の変異体の基質還元活性は、野生型酵素の活性を100%とすると、Asp98Ala(2.2%)、Asp98Glu(2.5%)、Asp98Asn(3.9%)であった。また、His255の変異体においては野生型酵素に対してHis255Ala(0.47%)、His255Arg(1.3%)、His255Lys(1.4%)であった。これらの結果は、His255の変異体の方がAsp98の変異体よりも酵素活性が低いことを示している。さらに、これらの変異体のうち、Asp98AlaとHis255Alaについて、酵素反応(pH7.0)におけるk_<cat>とk_m値を野生型のもの(380s^<-1>,37mM)と比較すると、それぞれ10s^<-1>,1550mMと1.7s^<-1>,520mMであった。また、これらの事実は、X線結晶改造解析によるタイプ2銅付近の構造から、Asp98残基はタイプ2銅に配位した基質との水素結合による基質の固定化と1プロトンの配給の役割を、His255残基は水分子を生成するためのもう1プロトン供給の役割を演じているものと考察された。Asp98残基の基質固定化については、Asp98Alaのk_m値がHis255Alaのものよりも大きいことから説明される。本酵素の反応機構として、次のようなものが提案された。まず、酸化状態のタイプ2銅にNO_2^<2->が配位し、次に電子伝達タンパク質から1電子を受け取ったタイプ1銅がそのタイプ2銅に移動させ、配位した基質がNO_2^<2->に還元される。そこへ2つのプロトンがAsp98とHis255から1づつ供給され、N-O結合が切断されてH_2OとNOが生成する。
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[Publications] S. Suzuki, N. Nakamura,K. Yamaguchi,K. Kataoka et al.: "Spectroscopic and Electrochemical Properties of Two Azurins from the Obligate Methylotroph Methylomonas sp. Stain J and Structure of Novel Az"Journal of Biological Inorganic Chemistry. 4. 749-758 (1999)
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[Publications] K. Kobayashi,S. Tagawa,Deligeer,S. Suzuki: "The pH-Dependent Changes of Intramolecular Electron Transfer on Copper-Containing Nitrite Reductase"Journal of Biochemistry. 126. 408-412 (1999)
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[Publications] T. Inoue,N. Nishino,S. Suzuki,K. Kataoka, T. Kohzumi,Y. Kai: "Crystal Structure Determinations of Oxidized and Reduced Pseudoazurins from Achromobacter cycloclastes"Journal of Biological Chemistry. 274. 17845-17852 (1999)
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[Publications] S. Suzuki,K. Kataoka,K. Yamaguchi,T. Inoue,Y. Kai: "Structure-Function Relationship of Copper-Containing Nitrite Reductases"Coordination Chemistry Review. 190-192. 245-265 (1999)
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[Publications] K. Kataoka, H. Furusawa, K. Tagagi,K. Yamaguchi,S. Suzuki: "Functional Analysis of Conserved Aspartate and Histidine Residues Located Around the Type 2 Copper Site of Copper-Containing Nitrite Reductase"Journal of Biochemistry. 127. 345-350 (2000)
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[Publications] S. Suzuki,H. Furusawa,K. Kataoka,K. Yamaguchi et al.: "Intramolecular Electron-Transfer Process of Native and Mutant Forms of Blue Copper-Containing Nitrite Reductase from Alcaligenes xylosoxidans"Inorganic Reaction Mechanism. (印刷中). (2000)
