ホヤによる金属イオンの濃縮・還元機構の分子生理学的解析

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11440244
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 道端 齊 広島大学, 大学院・理学研究科, 教授 (00111740)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 植木 龍也 広島大学, 大学院・理学研究科, 助手 (10274705) ; 宇山 太郎 広島大学, 大学院・理学研究科, 講師 (60232914) ; 金森 寛 富山大学, 理学部, 教授 (00019001)
• Keywords: ホヤ / バナジウム / 濃縮 / 還元 / cDNAクローニング / 金属結合

Research Abstract

この2年間で我々は以下の成果を挙げた。1.バナドサイトの細胞質から濃縮のカギを握る12.5kDa、15kDaと16kDaの3種類のVanabinをコードするcDNAの全長をクローニングし、2.それらの遺伝子の解析によってVanabinは{C}-{x(2-4)}-{C}という特徴的なモチーフの繰り返し配列を持ち、金属イオンと結合し易いシステインを約20%も含むタンパク質であること、3.NMRによって主にαヘリックスから成る新規のタンパク質であること、4.Vanabin 1モルに約20原子のバナジウムが結合し、その結合定数は10^<-7>Mであることを見出した。現在、5.部位特異的変異法によってバナジウム結合部位の特定を進めている。
一方、バナジウム濃縮のエネルギー機構を解明するため、6.その共役エネルギーの供給に携わる液胞膜のV-ATPaseのA,B,C,Dの各サブユニットの遺伝子の全長を明らかにした。7.その中でホヤに特有な配列を多く持つCサブユニットに着目して、Cサブユニットの機能を欠失した酵母にホヤのCサブユニット遺伝子を導入してプロトン輸送が回復することを確認した。このことはCサブユニットが高濃度のプロトン輸送に関わる可能性を示唆する。
さらに、バナドサイトでの金属イオンの濃縮機構の全容を解明するための基礎固めとして、8.バナドサイトのEST解析を行って、約300個の遺伝子を得た他、9.バナジウムアフィニティカラムを作製し、バナドサイトのホモジェネイトや可溶化した膜タンパク質さらに血漿中の金属結合タンパク質を網羅的に探索し、現在までに約50種のタンパク質を抽出した。10.得られたタンパク質の中で未知のタンパク質の金属イオンの濃縮機能をアッセイするための機能発現系を構築しつつある。また、11.バナドサイトの細胞膜と液胞膜からそれぞれ金属輸送体、金属ATPaseさらに硫酸イオン輸送体のホモログを複数個検出した。
この基盤研究によって、金属イオンの高選択的濃縮機構の解明に直接関与すると思われるVanabinの機能と構造を解明する手掛かりを得たばかりでなく、金属イオンの還元機構とその濃縮のエネルギー機構を解明するための基礎的要素を抽出することができ、研究は大きな展開点を迎えている。

Research Products

• [Publications] Michibata,H.: "The mechanism of accumulation and reduction of vanadium by ascidians."(Book Section)"The Biology of Ascidian" edit.by Sawada, H.,Yokosawa, H.and Lambert,C.C., Springer Tokyo. (in press.). (2001)
• [Publications] Ueki,T.: "Subunit C of the vacuolar-type ATPase from the vanadium-rich ascidians, Ascidia sydneiensis samea, rescued the pH sensitivity of yeast vma5 mutants."Marine Biotech.. (in press.). (2001)
• [Publications] Ueki,T.: "Exclusive expression of transketolase in the vanadocytes of the vanadium-rich ascidian, Ascidia sydneiensis samea."Biochim.Biophys.Acta. 1494. (2000)