ヒトメタロチオネインの立体構造と生体防御機能との相関に関する研究

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11450315
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 室岡 義勝 大阪大学, 大学院・工学研究所, 教授 (60029882)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 平山 令明 東海大学, 開発工学部, 教授 (70238393) ; 小野 比佐好 大阪大学, 遺伝情報実験施設, 助手 (40224274) ; 山下 光雄 大阪大学, 大学院・工学研究所, 助教授 (40220347)
• Keywords: 重金属 / メタロチオネイン / タンパク質工学 / SH基高含有タンパク質 / 重金属結合タンパク質

Research Abstract

メタロチオネインの構造と生体防御機能との相関について検証するため、タンパク質工学手法を用いてヒトメタロチオネインのアミノ酸置換を行い、タンパク質の主体構造を変換することにより重金属結合能、放射線耐性機能、活性酸素によるDNA損傷に対する防御機能及びフリーラジカルとの反応性に及ぼす影響を調べる目的で、下記の研究を行った。
1)大腸菌による野生型および変異型ヒトメタロチオネインタンパク質の生産精製方法の確立
大腸菌での異種遺伝子の発現生産系をさらに改良し、大腸菌によるSH基高含有重金属結合タンパク質の生産系を開発する研究を行った。遺伝子発現効率を上げるためにプロモーターや発現制御遺伝子を置換し、その下流に以前全合成したメタロチオネイン遺伝子およびアミノ酸置換した変異型メタロチオネイン遺伝子を連結し、遺伝子増幅によるタンパク質の生産効果を試験した。その結果、化学合成した2量体および4量体遺伝子は大腸菌で大量発現した。
2)変異メタロチオネインの重金属結合能の解析
上記で得られた2量体および4量体タンパク質を精製し、原子吸光光度系により重金属結合量を測定した。2量体および4量体はそれぞれモノマーの2倍、4倍のZnやCdを結合するとの結果を得た。
3)三次構造モデルの構築と重金属特異的結合能を有するタンパク質の開発
コンピューターグラフィックによりアミノ酸置換メタロチオネイン、および2量体、4量体の立体構造を解析し、重金属特異的結合能を解析する研究を行った。

Research Products

• [Publications] S.Nishikawa: "Rhodobacter sphaeroides mutants which accumulate 5-aminolivulinic acid under aerobic and dark conditions"Journal of Bioscience and Bioengineering. 87(6). 798-804 (1999)
• [Publications] 山下光雄: "有用酵素タンパク質の機能改良に関する研究"生物工学会誌. 77(8). 345-357 (1999)
• [Publications] 西矢芳昭: "機能改変コレステロールオキシダーゼの開発と応用"生物工学会誌. 77(10). 429-432 (1999)
• [Publications] Yoshinobu Kaneko: "Development of a host-vector system for Lactobacillus plantarum L137 isolated from a traditional fermented food produced in the Philippines."Journal of Bioscience and Bioengineering. 89(1)(印刷中). (2000)
• [Publications] S.-H. Hong: "Molecular design of novel metal-binding oligomeric human metallothioneins"Applied Microbiology and Biotechnology. (印刷中). (2000)
• [Publications] H.Nakayama: "Ectoine,the compatible solute of Halomonas elongata,confers hyperosmotic tolerance in cultured tobacco cells"Plant Physiology. (印刷中). (2000)
• [Publications] M.Yamashita: "Isolation,characterizaion, and molecular clonoing of a thermostable xylitol oxidase from Streptomyces sp. IKD472"Journal of Bioscience and Bioengineering. 89(1)(印刷中). (2000)