好塩性・好熱性酵素サーモライシンの活性発現機構の分子論,蛋白質工学および応用

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11460040
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 井上 國世 京都大学, 大学院・農学研究科, 教授 (10223249)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 滝田 禎亮 京都大学, 大学院・農学研究科, 助手 (70263126) ; 榊 利之 京都大学, 大学院・農学研究科, 助教授 (70293909)
• Keywords: 金属プロテアーゼ / サーモライシン / 好熱性酵素 / 好塩性酵素 / 蛋白質工学 / アスパルテーム / 酵素活性 / 塩類

Research Abstract

我々は、好熱性プロテイナーゼであるサーモライシン(TLN)の活性が高濃度の塩類の添加につれて指数関数的に増大し、飽和濃度のNaClの存在下に数十倍も増大することを報告した。さらに、高濃度の塩類の存在下に安定性も増大することを見出し、TLNは好塩性酵素であることを示した。本研究では、チロシン残基、リジン残基、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基を対象にして、化学修飾と部位特異的変位導入法により、電荷を付加、消去、反転させることを試み、活性と安定性に及ぼす効果を検討した。チロシン残基のニトロ化やアミノ化、リジン残基のTNBSによる修飾およびマレイミド化、またリジン残基にポリエチレングリコール(PEG)を付加した。一方、6個のセリン残基をアスパラギン酸に変換した。このような修飾と変異導入により、TLNの高度な好塩性が分子表面の静電的環境に依存することを見出した。PEGの付加により酵素活性が顕著に上昇した。これはPEGの付加により、またPEGに対する水和によりTLNの自由度が抑制されることに起因すると判断した。すなわち、あたかも高塩濃度存在下で、TLNの分子表面が静電場を失い、しかも自由度が抑制された状態に類似している。部位特異的導入により、活性部位S2サブサイトに存在するTrp-115を種々のアミノ酸残基に変換した。チロシンとフェニルアラニンに変換した変異型TLNでは、天然型酵素に比べ、活性がわずかに低下するものの80%以上の残存活性を維持した。一方、これら芳香族アミノ酸以外のアミノ酸に変換した変異酵素では全く活性を消失した。このことから、Trp-115は活性発現に重要な寄与をすることが示唆された。

Research Products

• [Publications] K.Morimoto: "Method for the preparation of Bispecific F(ab') 2μ fragments of mouse monoclonal antibody…"J. Immunol Methods. 224・1. 43-50 (1999)
• [Publications] T.Sakaki: "Enzymaric properties of human 25-hydroxy vitamin D3 12-hydroxylase expressed Escherichia coli"Eur.J. Biochem.. 259. 731-738 (1999)
• [Publications] T.Sakai: "Metabolic studies using recombinant E. coli cells producing rat mitochondrial CYP24"Eur. J. Biochem.. 262. 43-48 (1999)
• [Publications] N.Sawada: "Enzymatic properties of human 25 hydroxy vitamin 12-hydroxylase"Eur. J. Biochem.. 265. 950-956 (1999)
• [Publications] S.Kondo: "Electrostatic interaction between cytochrome P450 and NADPH-P450 reductase"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 257. 273-278 (1999)
• [Publications] K.Inouye: "Inhibitory effects of vitamin A and vitamin K on rat cytochrome P450 1A1-dependent・・"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 262. 565-569 (1999)
• [Publications] H.Oneda: "Refolding and recovery of recombinant human matrix metalloproteinase 7 .."J. Biochem.. 126. 905-911 (1999)
• [Publications] A.Tanaka: "Guanidine hydrochloride-induced denaturation of Pseudomonas cepacia lipase"J. Biochem.. 126. 382-386 (1999)
• [Publications] Y.Yamasaki: "Separation of amino acids and peptides by high-performance liquid chromatography"J. Liq. Chrom. Rel. Technol.. 22・13. 1965-1974 (1999)
• [Publications] S.Kitanaka: "No enzyme activity of 25-hydroxyvitamin D3 12-hydroxylase gene product in・・・"J. Clin Endocrinol. Metab.. 84. 4111-4117 (1999)
• [Publications] K.Adachi: "Relationship between the activity of glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase in hair follicles"Biosci. Biotechnol. Biochem.. 63. 2219-2221 (1999)
• [Publications] M.Kubo: "Mechanism of thermostability in thermolysin Analysis of subsite S2 mutant"Lett. Appl. Microbiol.. 28. 431-434 (1999)
• [Publications] T.Takita: "Lysyl-tRNA synthetase of Bacillus stearo-thermophilus.Molecular cloning and expression."Biosci.Biotechnol.Biochem.. 64・2. 432-437 (2000)
• [Publications] S.Jinno: "Total synthesis of a natural antioxidant and structure-activity relationships."Chem.Pharm.Bull.. 47・9. 1276-1283 (1999)
• [Publications] S.Jinno: "Total synthesis of a antioxidant isolated from yeast via palladium-catalyzed."Bioorg.Med.Chem.Lett.. 9. 1029-1032 (1999)
• [Publications] 井上 國世: "タンパク質の熱安定性の上限はどこにあるか?"化学と生物. 37・11. 738-739 (1999)
• [Publications] 井上 國世: "好熱性プロテイナーゼ、サーモライシンの好塩性と塩に依存する活性化の酵素化学"科学と工業. 73・11. 527-532 (1999)
• [Publications] 井上 國世: "酵素化学的および物理化学的手法を用いる大豆"大豆たん白質研究. 2. 20-27 (1999)
• [Publications] M. Okamoto: "Molecular Steroidogenesis"Universal Acadeny Press, Inc., Tokyo. 442 (2000)