2000 Fiscal Year Annual Research Report

好塩性・好熱性酵素サーモライシンの活性発現機構の分子論、蛋白質工学および応用

Research Project

Project/Area Number	11460040
Research Institution	KYOTO UNIVERSITY
Principal Investigator	井上國世京都大学, 農学研究科, 教授 (10223249)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	滝田禎亮京都大学, 農学研究科, 助手 (70263126) 榊利之京都大学, 農学研究科, 助教授 (70293909)
Keywords	金属プロテイナーゼ / サーモライシン / 亜鉛酵素 / アスパルテーム / マトリライシン / 部位特異的変異導入 / 酵素活性 / 酵素の安定性
Research Abstract	サーモライシン(TLN)産生菌のニトロソグアニジン処理により、2種の変異酵素(T1,T2)を得た。T1では、TLNのVal-140がAlaに、T2ではAla-73がValに変換されていた。T1はTLNに比べ、カゼイン分解活性が150%に増大したが、低分子ペプチド分解活性は35%に減少した。一方、T2ではカゼイン活性は10%に減少したのに対し、FAGLA活性は1200%に増大した。Val-140,Ala-73に対して、部位特異的変異導入を試みた。A73Vは人工甘味剤前胚体Z-Asp-Phe-OMe合成活性がTLNに比べて10倍増大し、ペプチド合成における有用性が示された。Ala-73とVal-140は、基質特異性の決定に大きい影響をもつことが示され、Ala-73へのかさ高い側鎖の導入により、蛋白質分解活性を抑制し、高いペプチド特異性を持つ酵素を創出できた。TLNの活性部位亜鉛をコバルトに置換した。本酵素の安定性はTLNと差異がないが、活性は5倍増大した。一方、遷移状態アナログによる阻害活性も5倍増大した。Co-TLNでは遷移状態の安定化により、活性が増大すると考えられた。Co-TLNはTLNと同様に高濃度の塩により顕著な活性化をうけた。塩による活性化は、Co-置換による活性化と相乗的であり、4M NaCl存在下のCo-TLNの活性はTLNより70倍も高い。ヒトマトリライシン(MLN)とTLNを比較した。MLN活性は塩濃度に依存して指数関数的に増大したが、TLNでは活性化がkcatのみに依存するのに対し、MLNではKmのみに依存した。MLNは高い熱安定性を示した(Tm=85℃)。4M尿素では完全失活したモルテングロビュル構造を取ることが示され、TLN活性ドメインと類似性を持つことが示唆された。

Research Products

(22 results)

All Other

All Publications (22 results)

[Publications] H.Oneda and K.Inouye: "Interaction of human matrix metallopnoteinase 7 (matrilysin) with the inhibitors, thiorphan…"J.Biochem. 129. 429-435 (2001)
[Publications] K.Inouye and S.Ohnaka: "Pepsin digestion of a mouse monoclonal antibody of I9G1 class formed F(ab')2…"J.Biochem.Biophys Methods. (印刷中). (2001)
[Publications] S.Okumura,S.Akao,K.Inouye 他2名: "Screening of the Bacillus thuringiensis Cry1AC δ - endotoxin on the…"J.Biochem.Biophys.Methods. (印刷中). (2001)
[Publications] K.Inouye,S.Kondo,M.Yamamura 他2名: "Inhibitory effects of detergents on rat CYP1A1 - dependent monooxygenase."Biochem.Biophys.Res.Commun.. (印刷中). (2001)
[Publications] K.Inouye,T.mizokawa,A.Saito 他3名: "Biphasic Kinetic behavior of rat Cytochrome P4501A1 - dependent monooxygenation…"Biochim.Biophys.Acta. 1481・2. 265-272 (2000)
[Publications] T.Sakaki and K.Inouye: "Practical application of mammalian cytochrome P450"J.Biosci.Biotechnol.. 90. 583-590 (2000)
[Publications] K.Inouye,A.Saito,M.Orita 他3名: "Inhibitory effects of 1, 4 - naphthoquinones on rat cytochrome P4501A1 - dependent…"J.Biochem.. 127・6. 1041-1046 (2000)
[Publications] H.Oneda and K.Inouye: "Effects of dimethyl sulfoxide, temperature, and sodium chloride on the activity…"J.Biochem.. 128・5. 785-791 (2000)
[Publications] N.Sawada,T.Sakaki,K.Inouye 他1名: "metabolism of vitamin D3 by human CYP27A1"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 273・3. 977-984 (2000)
[Publications] K.Inouye,H.Tanaka,and H.Oneda: "States of tryptophyl residues and stability of recombinant human matrix…"J.Biochem.. 128・3. 363-369 (2000)
[Publications] T.Takita,N.Shimizu,K.Inouye 他7名: "Lysyl tRNA synthetase of Bacillus stearothermophilus."Biosci.Biotechnol.Biochem.. 64・2. 432-437 (2000)
[Publications] K.hayashi,T.Sakaki,K.Inouye 他2名: "Coexpression of genetically engineered fused enzymes between yeast NAPPH - P450 reductase"Anch.Biochem.Biophys.. 381・1. 164-170 (2000)
[Publications] K.Monimoto and K.Inouye: "Application of bispecific F (a b')2μ fragments prepared from IgMS against CEA…"Clin.Chem.. 46. 1492-1493 (2000)
[Publications] T.Sakaki,N.Sawada,K.Kamai,K.Inouye 他4名: "Dual metabolic pathways of 25-hydroxy vitamin D3 catalyzed by human CYP24"Eur J. Biochem.. 267. 6158-6165 (2000)
[Publications] 榊利之,井上國世: "ビタミンD24-水酸化酵素の生理作用"季刊腎と骨代謝. 13・2. 129-135 (2000)
[Publications] 井上國世,滝田禎亮,永井宏平: "プロテアーゼによる分離大豆たん白質の凝集反応の考察"大豆たん白質研究. 3. 22-28 (2000)
[Publications] K.Inouye and T.Sakaki: "Enzymatic studies on the key enzymes of vitamin D metabolism."biotechnol.Ann.Rev.. 7. 179-194 (2001)
[Publications] K.Inouye: "Handbook of Food Enzymology (J.R.Whitaker 他3名編)"Mercel Dekker(印刷中). (2001)
[Publications] N.Sawada,T.Sakaki,K.Inouye 他3名: "Molecular Steroidogenesis (M.Okamoto,Y.Ishimura and H.Nawata 編)"Universal Academy press, Tokyo. 442 (2000)
[Publications] T.Sakaki,N.Sawada,K.Inouye 他2名: "Molecular Steroidogenesis (M,Okamoto,Y.Ishimura, and H.Nawata 編)"Universal Academy Press, Tokyo. 442 (2000)
[Publications] 井上國世: "動物細胞工学ハンドブック"朝倉書店. 362 (2000)
[Publications] 井上國世: "酵素ハンドブック(第3版)"朝倉書店(印刷中). (2001)

2000 Fiscal Year Annual Research Report

好塩性・好熱性酵素サーモライシンの活性発現機構の分子論、蛋白質工学および応用

Principal Investigator

井上 國世 京都大学, 農学研究科, 教授 (10223249)

Research Products

[Publications] H.Oneda and K.Inouye: "Interaction of human matrix metallopnoteinase 7 (matrilysin) with the inhibitors, thiorphan…"J.Biochem. 129. 429-435 (2001)

[Publications] K.Inouye and S.Ohnaka: "Pepsin digestion of a mouse monoclonal antibody of I9G1 class formed F(ab')2…"J.Biochem.Biophys Methods. (印刷中). (2001)

[Publications] S.Okumura,S.Akao,K.Inouye 他2名: "Screening of the Bacillus thuringiensis Cry1AC δ - endotoxin on the…"J.Biochem.Biophys.Methods. (印刷中). (2001)

[Publications] K.Inouye,S.Kondo,M.Yamamura 他2名: "Inhibitory effects of detergents on rat CYP1A1 - dependent monooxygenase."Biochem.Biophys.Res.Commun.. (印刷中). (2001)

[Publications] K.Inouye,T.mizokawa,A.Saito 他3名: "Biphasic Kinetic behavior of rat Cytochrome P4501A1 - dependent monooxygenation…"Biochim.Biophys.Acta. 1481・2. 265-272 (2000)

[Publications] T.Sakaki and K.Inouye: "Practical application of mammalian cytochrome P450"J.Biosci.Biotechnol.. 90. 583-590 (2000)

[Publications] K.Inouye,A.Saito,M.Orita 他3名: "Inhibitory effects of 1, 4 - naphthoquinones on rat cytochrome P4501A1 - dependent…"J.Biochem.. 127・6. 1041-1046 (2000)

[Publications] H.Oneda and K.Inouye: "Effects of dimethyl sulfoxide, temperature, and sodium chloride on the activity…"J.Biochem.. 128・5. 785-791 (2000)

[Publications] N.Sawada,T.Sakaki,K.Inouye 他1名: "metabolism of vitamin D3 by human CYP27A1"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 273・3. 977-984 (2000)

[Publications] K.Inouye,H.Tanaka,and H.Oneda: "States of tryptophyl residues and stability of recombinant human matrix…"J.Biochem.. 128・3. 363-369 (2000)

[Publications] T.Takita,N.Shimizu,K.Inouye 他7名: "Lysyl tRNA synthetase of Bacillus stearothermophilus."Biosci.Biotechnol.Biochem.. 64・2. 432-437 (2000)

[Publications] K.hayashi,T.Sakaki,K.Inouye 他2名: "Coexpression of genetically engineered fused enzymes between yeast NAPPH - P450 reductase"Anch.Biochem.Biophys.. 381・1. 164-170 (2000)

[Publications] K.Monimoto and K.Inouye: "Application of bispecific F (a b')2μ fragments prepared from IgMS against CEA…"Clin.Chem.. 46. 1492-1493 (2000)

[Publications] T.Sakaki,N.Sawada,K.Kamai,K.Inouye 他4名: "Dual metabolic pathways of 25-hydroxy vitamin D3 catalyzed by human CYP24"Eur J. Biochem.. 267. 6158-6165 (2000)

[Publications] 榊利之,井上國世: "ビタミンD24-水酸化酵素の生理作用"季刊 腎と骨代謝. 13・2. 129-135 (2000)

[Publications] 井上國世,滝田禎亮,永井宏平: "プロテアーゼによる分離大豆たん白質の凝集反応の考察"大豆たん白質研究. 3. 22-28 (2000)

[Publications] K.Inouye and T.Sakaki: "Enzymatic studies on the key enzymes of vitamin D metabolism."biotechnol.Ann.Rev.. 7. 179-194 (2001)

[Publications] K.Inouye: "Handbook of Food Enzymology (J.R.Whitaker 他3名 編)"Mercel Dekker(印刷中). (2001)

[Publications] N.Sawada,T.Sakaki,K.Inouye 他3名: "Molecular Steroidogenesis (M.Okamoto,Y.Ishimura and H.Nawata 編)"Universal Academy press, Tokyo. 442 (2000)

[Publications] T.Sakaki,N.Sawada,K.Inouye 他2名: "Molecular Steroidogenesis (M,Okamoto,Y.Ishimura, and H.Nawata 編)"Universal Academy Press, Tokyo. 442 (2000)

[Publications] 井上國世: "動物細胞工学ハンドブック"朝倉書店. 362 (2000)

[Publications] 井上國世: "酵素ハンドブック(第3版)"朝倉書店(印刷中). (2001)

井上國世京都大学, 農学研究科, 教授 (10223249)

[Publications] 榊利之,井上國世: "ビタミンD24-水酸化酵素の生理作用"季刊腎と骨代謝. 13・2. 129-135 (2000)

[Publications] K.Inouye: "Handbook of Food Enzymology (J.R.Whitaker 他3名編)"Mercel Dekker(印刷中). (2001)