生理活性微生物ジテルペンの骨格形成・環化酵素遺伝子のクローニングと開発研究

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11460053
• Research Institution: Yamagata University
• Principal Investigator: 佐々 武史 山形大学, 農学部, 教授 (80023456)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 三橋 渉 山形大学, 農学部, 助教授 (50192761) ; 豊増 知伸 山形大学, 農学部, 助教授 (60272085) ; 加藤 修雄 九州大学, 機能物質科学研究所, 助教授 (50150537)
• Keywords: アフィジコリン / ジテルペン環化酵素 / クローニング / 環化酵素遺伝子 / フシコクシン / ジテルペン炭化水素 / 生合成 / コパリル二リン酸

Research Abstract

アフィジコリンの生合成環状ジテルペン炭化水素の存在を確認するために、アフィジコリン生産菌の菌体成分を精査した結果、目的の環状ジテルベン炭化水素類としてaphidicol-15-ene、aphidicol-16-ene及びaphidicolan-16β-olを、さらに糸状菌では最初のstemar-13-eneと8β-pimara-9(11),15-diene等を同定した。そこで、その生合成中間体の環化を触媒する酵素遺伝子をRT-PCRによりクローニングし、その遺伝子を大腸菌内で発現させた組換えタンパク質を用いた変換実験を行ったところ、aphidicolan-16β-olを主生成物として同定した。このことは、アフィジコリン生合成中間体の環化を触媒する酵素遺伝子のクローニングに成功したことを示す。次に、フシコクシンの生合成環状ジテルぺン炭化水素fusicocca-2,10(14)-dieneをゲラニルゲラニル二リン酸から生成する酵素の存在を確認するために、フシコクシン生産菌F6株のセルフリー系を構築し、この系でゲラニルゲラニル二リン酸がfusicocca-2,10(14)-dieneに変換することをガスクロマト的に明らかにした。そこで、その酵素をコードする遺伝子をクローニングするために、RT-PCRやcDNAライブラリーの無作為シークエンスなどを駆使してスクリーニングしたが、目的の遺伝子は得られなかった。現在、そのクローニング研究を続行している。また、フシコクシンの重要な生合成中間体であるfusicocca-2,10(14)-diene-8β-olの構造確認のため、それからアフィジコリンの重要な生合成中間体aphidicolan-16β-olの生合成前駆体と考えられるsyn-コパリル二リン酸を、それぞれ立体特異的に全合成することに成功した。

Research Products

• [Publications] Takeshi Sassa et al.: "Conversion of [19-^2H_2] fusicocca-2, 10(14)-diene into its 8β-ol and fusicoccins by phomopsis (fusicoccum) amygdali."Tetrahedron Lett.. 41. 2401-2404 (2000)
• [Publications] Hiroaki Toshima et al: "Tatal synthesis of bath enantiomers of copalol via optical resolution of general synthetic intermediate for drimane sesquiterpenes and labdane diterpenes."Tetrahedron. 56. 8443-8450 (2000)
• [Publications] Hideaki Oikawa et al: "Diversity of diterpene hydrocarbons in fungus Phoma betae."Tetrahedron Lett.. 42(in press). (2001)