発生工学的手法による原虫感染防御機構の分子免疫学的解析

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11460144
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine
• Principal Investigator: 長澤 秀行 帯広畜産大学, 原虫病分子免疫研究センター, 教授 (60172524)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 豊田 裕 帯広畜産大学, 原虫病分子免疫研究センター, 名誉教授 (90050418) ; 五十嵐 郁男 帯広畜産大学, 原虫病分子免疫研究センター, 助教授 (80159582) ; 藤崎 幸蔵 帯広畜産大学, 原虫病分子免疫研究センター, 教授 (00292095) ; 横山 峯介 三菱化学, 生命科学研究所, 室長 ; 鈴木 宏志 中外製薬, CSKリサーチパーク, 研究主査
• Keywords: 原虫病 / Toxoplasma gondii / Neospora caninum / Cryptosporidium parvum / トランスジェニックマウス / アポトーシス / 感染防御機構 / P0蛋白質

Research Abstract

1.原虫検出感染防御機構に関与する遺伝子の決定
(1)各原虫に対するモノクローナル抗体の作製
トリパノソーマ、ネオスポーラ原虫に関して、培養あるいは実験動物を用いて抗原を採集し、原虫特異抗原を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製した。
(2)免疫原生蛋白質の同定と機能解析
モノクローナル抗体により認識される抗原蛋白質をWestern blot法,間接蛍光抗体法、共焦点レーザー顕微鏡により同定するとともに、それぞれの抗体の中和活性を調べることにより、各蛋白質の原虫分化・増殖、細胞内侵入性、生存率に及ぼす影響を検討し、感染防御能機構への関与を解析した。
(3)免疫原生蛋白質をコードする遺伝子のクローニングと塩基配列の解読
モノクローナル抗体をプローブとして、cDNAライブラリーを作製し、特異抗原をコードする遺伝子クローンを選択し、クローニング後、トリパノソーマのP0蛋白をコードする遺伝子の塩基配列を決定する。
2.遺伝子改変マウスを用いた原虫感染実験
既に保有しているトキソプラズマP30トランスジェニックマウス、IL-1ノックアウトマウス、IFNγノックアウトマウス、スカベンジャーレセプターノックアウトマウス、TNFαレセプターノックアウトマウスに各種原虫を接種し、感染経過を野生型および免疫不全マウス(ヌードおよびスキットマウス)と比較検討した。
(1)トキソプラズマ原虫の感染実験
P30トランスジェニックマウスにBeverley株bradyzoiteを腹腔内接種し、感染抵抗性の減弱がサイトカインパターンの違いに起因する事実を明らかにした。
(2)クリプトスポリジウム原虫の感染実験
クリプトスポリジウム(Cryptosporidium paruvum)のオーシストをスキットマウスに経口接種し、感染量とオーシストの排泄数および生存率との関連性を検討した。
(3)ネオスポーラ原虫の感染実験
ネオスポーラ原虫の増殖型虫体を腹腔内接種し、感染経過を抗体価の推移、脳内シスト数および生存率を指標として検討した結果、アポトーシスの誘導が宿主防御機構に重要である事実を明らかにした。

Research Products

• [Publications] Ikadai H.et al.: "Cloning and expression of a 48-kilodalton Babesia caballi merozoite rhoptry protein and potential use of the recombinant antigen in an enzyme-linked immunosorbent assay"J. Clin. Microbiol.. 37. 3475-3480 (1999)
• [Publications] Xuan X.et al.: "Characterization of P15 antigen of Cryptosporidium parvum expressed by a recombinant vaccinia virus"J. Protozool. Res.. 9. 32-40 (1999)
• [Publications] Tanaka T.et al.: "Expression of recombinant Toxoplasma gondii P24"J. Vet. Med. Sci.. 61. 1235-1239 (1999)
• [Publications] Tanaka T.et al.: "Expression of Babesia equi merozoite antigen-2 by recombinant baculovirus and its use in the ELISA"Int. J. Parasitol.. 29. 1803-1808 (1999)
• [Publications] Ikadai H.et al.: "Inhibitory effect of monoclonal antibodies on the growth of Babesia caballi"Int. J. Parasitol.. 29. 1785-1791 (1999)
• [Publications] Seng S.et al.: "Increased susceptibility to Toxoplasma gondii infection in SAG-1 transgenic mice"Int. J. Parasitol.. 29. 1433-1436 (1999)