発生工学的手法による原虫感染防御機構の分子免疫学的解析

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11460144
• Research Institution: Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine
• Principal Investigator: 長澤 秀行 帯広畜産大学, 原虫病研究センター, 教授 (60172524)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 豊田 裕 帯広畜産大学, 原虫病研究センター, 名誉教授 (90050418) ; 五十嵐 郁男 帯広畜産大学, 原虫病研究センター, 教授 (80159582) ; 藤崎 幸蔵 帯広畜産大学, 原虫病研究センター, 教授 (00292095) ; 横山 峯介 三菱化学, 生命科学研究所, 室長 ; 鈴木 宏志 中外製薬, CSKリサーチパーク, 研究主査
• Keywords: 原虫病 / Toxoplasma gondii / Neospora caninum / Cryptosporidium parvum / トランスジェニックマウス / アポトーシス / 感染防御機構 / P0蛋白質

Research Abstract

1.原虫検出感染防御機構に関与する遺伝子の決定
(1)各原虫の免疫原性蛋白質を同定し、塩基配列の同定をおこなった。
トキソプラズマ、バベシア、トリパノソーマ、ネオスポーラ原虫に関して、培養あるいは実験動物を用いて抗原を採集し、原虫特異抗原を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製した。モノクローナル抗体により認識される抗原蛋白質をWestern blot法,間接蛍光抗体法、共焦点レーザー顕微鏡により同定するとともに、それぞれの抗体の中和活性を調べることにより、各蛋白質の原虫分化・増殖、細胞内侵入性、生存率に及ぼす影響を検討し、感染防御能機構への関与を解析した。モノクローナル抗体をプローブとして、cDNAライブラリーを作製し、特異抗原をコードする遺伝子クローンを選択し、クローニング後、蛋白をコードする遺伝子の塩基配列を決定した。
2.遺伝子改変マウスを用いた原虫感染実験
既に保有しているトキソプラズマP30トランスジェニックマウス、IL-1ノックアウトマウス、IFNγノックアウトマウス、スカベンジャーレセプターノックアウトマウス、TNFαレセプターノックアウトマウスに各種原虫を接種し、感染経過を野生型および免疫不全マウス(ヌードおよびスキットマウス)と比較検討した。
(1)感染実験による抗原提示細胞の重要性
トキソプラズマP30トランスジェニックマウスにBeverley株bradyzoiteを腹腔内接種し、感染抵抗性の有無が抗原提示細胞の種類(樹状細胞、マクロファージ)により左右されること。また、これがサイトカインパターンの違いに起因する事実を明らかにした。
(2)クリプトスポリジウム原虫の感染実験
クリプトスポリジウム(Cryptosporidium paruvum)のオーシストをスキットマウスに経口接種し、感染量とオーシストの排泄数および生存率との関連性を検討した。
(3)ネオスポーラ原虫の感染実験
ネオスポーラ原虫の増殖型虫体を腹腔内接種し、感染経過を抗体価の推移、脳内シスト数および生存率を指標として検討した結果、インターフェロンの作用により誘導されるアポトーシスが宿主防御機構に重要である事実を明らかにした。

Research Products

• [Publications] Nishikawa,Y. et al.: "Delivery of Neospora caninum surface protein, NcSRS2 (Nc-p43), to mouse using recombinant vaccinia virus."Parasitol.Res.. 86. 934-939 (2000)
• [Publications] Nishikawa,Y. et al.: "Immunisation of dogs with a canine herpesvirus vector expressing Neospora caninum surface protein, NcSRS2."Int.J.Parasitol.. 30. 1167-1171 (2000)
• [Publications] Inoue,N. et al.: "Novel species specific antigens of Trypanosoma congolense and their different localization among life-cycle stages."J.Vet.Med.Sci.. 62. 1041-1045 (2000)
• [Publications] Igarashi,I. et al.: "Immunization with recombinant surface antigens p26 with Freund's adjuvants against Babesia rodhaini infection."J.Vet.Med.Sci.. 62. 713-723 (2000)
• [Publications] Ikadai,H. et al.: "Protein analysis of Babesia caballi merozoites by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis and western blotting."J.Vet.Med.Sci.. 62. 323-327 (2000)
• [Publications] Seng,S. et al.: "Expression of SAG-1 of Toxoplasma gondii in transgenic mice."Parasitol.Res.. 86. 263-269 (2000)