2000 Fiscal Year Annual Research Report
組み換え糖鎖を有する完全リコンビナントプロテオグリカンの合成
| Project/Area Number |
11470029
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
遠藤 正彦 弘前大学, 医学部, 教授 (20004616)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岩船 美都 弘前大学, 医学部, 助手 (80312487)
柿崎 育子 弘前大学, 医学部, 助手 (80302024)
高垣 啓一 弘前大学, 医学部, 助教授 (70163160)
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| Keywords | 糖鎖組み換え / エンド型グリコシダーゼ / ヒアルロニダーゼ / プロテオグリカン / グリコサミノグリカン / キシロシル-MU-オリゴ糖 |
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| Research Abstract |
研究目的
プロテオグリカンの糖鎖・グリコサミノグリカンには、生物活性ドメイン構造が組み込まれている。しかし、この高分子糖鎖の有機化学的な合成はできず、また合成酵素も見出されていない。そこで、エンド型グリコシダーゼの加水分解反応の逆反応としての糖転移反応を利用した糖鎖の組み換え法の確立をめざした。
研究方法
1.エンド型グリコシダーゼ:精巣性ヒアルロニダーゼの糖転移反応を利用して糖鎖を再構築する。そのより良い条件の検討をする。
2.転移される糖鎖のアクセプターの検討:どのような糖鎖構造のアクセプターが転移されやすいかを調べる。また、培養細胞が産生する、キシロシル-4-メチルウンベリフェロン(Xyl-MU)をプライマーとして伸長したオリゴ糖が、アクセプターとしてペプチドへの導入のキャリヤーとしての有効性を調べる。
3.糖転移反応のドナーとしての糖鎖の吟味:どのような糖鎖構造が転移されやすいかを調べる。
研究成果
1.ヒアルロニダーゼによる糖転移の効率的条件を調べたところ、Mn^<2+>の添加とNaClの非存在下の条件が優れていた。
2.アクセプターとしての糖鎖の条件は、非還元末端位にグルクロン酸を有する四糖以上の糖鎖で、そのグルクロンサンの次の還元末端側には、N-アセチルガラクトサミンまたはグルコサミンで、硫酸基は1ヶのみ置換していると効率がよいが、例外的にN-アセチルガラクトサミン4,6-ジ硫酸でも良い。Xyl-MUオリゴ糖も優れたアクセプターである。
3.ドナーとしては、従前報告した以外に、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン4-硫酸、6-硫酸、の他に脱硫酸化デルマタン硫酸も転移可能である。
4.組み換えによる約100種類のオリゴ糖鎖を合成した。それを基質として用い、未確定であったヒアルロニダーゼSDの作用機序を初めて明らかにした。
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[Publications] Takagaki,K. et al.: "Enzymatic reconstruction of dermatan sulfate."Biochem.Biophys.Res.Commun.. 270. 588-593 (2000)
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[Publications] Takagaki,K. et al.: "Chimeric glycosaminoglycan oligosaccharides synthesized by enzymatic reconstruction and their use in substrate specificity determination of Streptococcus hvaluronidase."J.Biochem.. 127. 695-702 (2000)
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[Publications] Munakata,H. et al.: "Interaction between collagens and glycosaminoglycans investigated using a surface plasmon resonance biosensor."Glycobiology. 9. 1023-1027 (1999)
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[Publications] Takagaki,K. et al.: "Enzymatic reconstruction of a hybrid glycosaminoglycan containing 6-sulfated, 4-sulfated, and unsulfated N-acetylgalactosamine."Biochem.Biophys.Res.Commun.. 258. 741-744 (1999)
