細胞防御系ハウスキーピング酵素Class III ADHのアルコール代謝における役割-ノックアウトマウスを用いるin vivo実験と酵素の活性調節機構解明のためのin vitro実験-

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11470120
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Nippon Medical School
• Principal Investigator: 長谷場 健 日本医科大学, 医学部, 講師 (50156329)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山本 伊佐夫 神奈川歯科大学, 歯学部, 助手 (30277917) ; 亀山 孝二 日本医科大学, 医学部, 助手 (60150736) ; 真下 啓子 日本医科大学, 医学部, 助手 (90113000) ; 黒沢 則夫 創価大学, 工学部, 講師 (30234602) ; 清水 昭夫 創価大学, 工学部, 助教授 (20235641)
• Keywords: Class I ADH / Class III ADH / Class III ADH遺伝子クローニング / マウス / アルコール代謝 / 肝ADH酵素量 / 活性・構造相関 / ADH大量発現系

Research Abstract

1.Class III ADH遺伝子(Adh3)knock out mouse作製のためのAdh3 cloning:BAC/129vJ mouse genome libraryからPCR法にて3種のAdh3 positive BAC clonesをscreeningし、insertを制限酵素処理後、pZEro-1 vectorにsubcloningして、4種のpositive clonesを選出した。現在、これらのcloneのinsertをmappingによって同定中。
2.Class IとClass III ADHのethanol pharmacokineticsにおける役割:mouseにEtOHを1-5g/kg投与して、肝ADH活性、Class IおよびClass III酵素量を測定し、pharmacokinetic parametersとの関係を統計学的に解析した結果、血中EtOH消失は投与量の増大に伴って、主にClass Iに依存したMichaelis-Menten kineticsからClass III依存のfirst-order kineticsに移行することが示唆された。
3.2量体ウマADH(Class I)と4量体酵母ADHを用いて、尿素存在下で活性-構造相関を検討したところ、ウマADHでは解離前に失活が、酵母ADHでは解離と共に失活が観察され、両者の活性-構造相関に相違がみられた。3次および2次構造の変化は両者とも解離後同時に観察された。
4.Class IとClass III ADHのcDNAをexpression vector pET3に入れ、E.coli BL21をtransformして、それらの発現をSDS-PAGEで検討した。Class IIIは菌体蛋白の約5%の発現が見られたが、Class Iでは微弱な発現しかなかったため、現在、その発現系を再検討中。

Research Products

• [Publications] Mori O,Haseba T, et.al.: "Histological distribution of class III ADH in human brain"Brain Research. 852. 186-190 (2000)
• [Publications] 亀山孝二、長谷場健 他: "冠動脈平滑筋細胞の膜傷害とアルコール脱水素酵素(ADH)の発現"脈管学. 40(発表予定). (2000)