2000 Fiscal Year Annual Research Report
細胞防御系ハウスキーピング酵素Class III ADHのアルコール代謝における役割-ノックアウトマウスを用いるin vivo実験と酵素の活性調節機構解明のためのin vitro実験-
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11470120
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| Research Institution | Nippon Medical School |
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Principal Investigator |
長谷場 健 日本医科大学, 医学部, 講師 (50156329)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山本 伊佐夫 神奈川歯科大学, 歯学部, 助手 (30277917)
亀山 孝二 日本医科大学, 医学部, 助手 (60150736)
真下 啓子 日本医科大学, 医学部, 助手 (90113000)
黒沢 則夫 創価大学, 工学部, 助教授 (30234602)
清水 昭夫 創価大学, 工学部, 助教授 (20235641)
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| Keywords | Class I ADH / Class III ADH / Class III ADH遺伝子 / ノックアウトマウス / アルコール代謝 / リコンビナントADH / 活性・構造相関 / ADH強発現株細胞 |
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| Research Abstract |
1.Mouse genome DNA-BAC libraryからintron 1-exon 2部位に対するPCR作成probeでClass III ADH遺伝子(Adh)陽性clonesをscreeningし、制限酵素処理後pZERO vectorにsubcloningした。制限酵素地図作成および各exon部のPCR作成probeでhybridizationを行った結果、(1)Exon 1を含む5'上流の16Kpb、(2)Intron 1の一部からintron 6の一部を含む9.2Kbp、(3)Exon 6から3'下流を含む13.6Kbpの3 cloneを同定し、これらでAdh3の5'上流15.3Kbpと3'下流8.6Kbpを含む全長36.7Kbpをcoverすることがわかった。現在、これらcloneの塩基配列を決定中。
2.米国Burnham研究所からAdh1またはAdh3 knock out(KO)mouseの2系統のKO mouseを入手した。またwild typeをC57BL/6(♀)×129SvJ(♂)のF1同志の交配により作成した。現在これら3系統のmouseを飼育繁殖中である。(我々はcloningしたマウスAdh3遺伝子を用いてAdh3 KO mouseを作成する予定であったが、この間に当研究所のDr.Duesterらによって当該KO mouseの作成が報告されたので、我々は彼らにその分与を依頼し、購入した。)
3.E.coliにおけるマウスClass III ADH発現系MADH3/pET3/BL21を作成し、recombinant mouse Class III ADH大量発現と精製法を確立し、収量4mg精製酵素/1L培地を得た。現在、マウスClass I ADH発現系も作成中であり、今後これらrecombinant ADHを用い、両ADHの活性・構造相関を種々の条件で検討する。
4.Class III ADH強発現培養細胞株を樹立するため、CAG promoterの下流にマウスClass III ADHcDNA、B19 promoterの下流に緑色蛍光蛋白質遺伝子持ったAAV vector plasnmidを構築した。これとTKneo^R plasmidとを3T3株細胞にcotransfectionし、G418でselectionした結果、Class III ADH活性がControlに比べ2〜4倍高い細胞株が数clone得られた。今後、これらのADH強発現細胞株を用いて、アルコールの代謝およびその細胞障害性を比較検討する。
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[Publications] Mori O,Haseba T, et al.: "Histological distribution of Class III ADH in human brain"Brain Reseach. 852. 186-190 (2000)
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[Publications] 亀山孝二,長谷場健 他: "冠動脈平滑筋細胞の膜傷害とアルコール脱水素酵素(ADH)の発現"脈管学. 40. 259-266 (2000)
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[Publications] Haseba T,Kameyama K, et al.: "Dose-dependent change in pharmacokinetics of ethanol in mice due to shifting the dominant metabolizing enzyme from liver Class I ADH to Class III ADH."Alcoholism : Exp.Clin.& Res.. Suppl 24. 199A (2000)
