1999 Fiscal Year Annual Research Report
アポトーシス促進因子baxを用いたPTCA後再狭窄に対する遺伝子治療の可能性
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11470160
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Gifu University |
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Principal Investigator |
藤原 久義 岐阜大学, 医学部, 教授 (80115930)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹村 元三 岐阜大学, 医学部・附属病院, 講師 (40283311)
岡野 幸雄 岐阜大学, 医学部, 教授 (10177066)
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| Keywords | mouth muscle cells / apoptosis / bax mRNA / TUNEL / electron microscopy / DNA ladder |
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| Research Abstract |
本年度はラット培養平滑筋細胞およびマクロファージにbax遺伝子を導入し、アポトーシスが誘導出来るか否かを検討した。ラット培養平滑筋細胞(SMC)よりRNAを抽出し、RT-PCR法にてbax mRNAに相補的な塩基配列を持つbax cDNAを合成し、大腸菌内で増幅し、精製した。このbax cDNAをアデリウイルスに組み込み、bax遺伝子発現ベクターを作成した。このbax遺伝子をラット培養SMCおよびマクロファージに導入した。まず、bax mRNAおよびBax蛋白が増大することをノーザンブロット法およびウエスターン法で確認した。Bax遺伝子導入SMCおよびマクロファージではコントロールとしての非導入SMCやマクロファージに比較し、SMCおよびマクロファージの死が有意に増大した。このSMC死のメカニズムかアポトーシスかネクローシスかを鑑別するためにアポトーシスのマーカーであるTUNEL,DNA ladder,Taq-polymerase based in situligation法および電顕にて観察した。その結果、TUNEL陽性&Taq-polymerase based in situ ligation陽性のSMCやマクロファージの増大、DNA ladderの陽性化および電顕的にアポトーシスの所見(核クロマチンの半月状または三日月状の凝集、細胞のschrinkage、アポトーシス小体)が見られた。ネクローシスのマーカーであるPfu染色はコントロールのSMC&マクロファージと同様であった。これらは培養中のartifactと思われた。以上によりbax mRNA導入はSMCのアポトーシスを誘導することが明らかになった。
次に上記bax mRNA導入によるアポトーシスSMCモデルにTNF-αを添加したところ、SMCのアポトーシスの増大が見られた。すなわちTNF-αはSMCのアポトーシスに対し相乗効果を示した。
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Research Products
(5 results)
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[Publications] Hayakawa Y, et al.: "Apoptosis and overexpression of Bax protein and bax mRNA in smooth musde cells with in intimal hypeplasia of human radal ateies-Analysis using ateiovenous fistulas for hemodalysis"Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology. 19(3). 2066-2077 (1999)
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[Publications] Kumada H, et al.: "Hydrogen peroxide-inducedphospholipase D activation in human vascular smooth muscle cells"Biomed Res. 20(6). 87-98 (1999)
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[Publications] Nakamura M, et al.: "Sudden pressure elevation can trigger acute muscle cell death of the heart and aotra"Atherosclerosis. 146(2). 25-32 (1999)
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[Publications] Yokoya K, et al.: "Process of progression of coronary artery lesions from mild or moderate stenosis to moderate or severe stenosis"Circulation. 100(9). 903-909 (1999)
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[Publications] Kanoh M, et al.: "Significance of myocytes with positive DNA in situ nick end-labelingin hearts with dilated cardimyopathy"Circulation. 99(6). 2757-2764 (1999)
