2000 Fiscal Year Annual Research Report
ジストロフィン生理機能解明と平滑筋機能から見たDMD遺伝子治療開発に関する研究
| Project/Area Number |
11470172
|
|---|
| Research Institution | Kumamoto University |
|---|
Principal Investigator |
三池 輝久 熊本大学, 医学部, 教授 (90040617)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤井 績 熊本大学, 医学部・附属病院, 医員
木村 重美 熊本大学, 医学部・附属病院, 助手 (60284767)
|
|---|
| Keywords | ジストロフィン / トランスジェニックマウス / 発現調節機構 / 遺伝子治療 / プロモーター / 血管平滑筋 |
|---|
| Research Abstract |
DMDでは筋膜でジストロフィン(dy)が欠損しているが筋壊死のメカニズム及びdyの生理作用は未だに不明である。我々はDMDで筋崩壊が起こるメカニズムには血管平滑筋の機能障害に伴う血流異常と血液凝固系の亢進が関与していると考えるに至っている。そこで、mdxマウス血管平滑筋にdyを発現させたトランスジェニックマウス作製し、血管病変に由来する筋壊死の有無を検討すればdyの生理機能についての大きな情報が得られるのではないかと考えた。まず、トランスジェニック作製用のコンストラクトを作製することが必要であるがこの作業にこれまで時間を費やしてきた。手順は以下の通りで、コンストラクト作製に必要な制限酵素、ApaI,SpeI,HindIII,NotI,SalI,EcoRI,PstI,のサイトを持つオリゴDNAを作製する、このオリゴDNAをBluescript II KS-のApaIとPstIで切断したベクターにライゲーションする。その後、そのサイトを利用してSV40のPolyA signal.心臓と平滑筋特異的に発現させる(骨格筋には発現させない)。ヒト平滑筋α-アクチンプロモーター(EA4.7)、ジストロフィンcDNAをライゲーションする。更にに、このコンストラクトが機能するかmdxマウスの心臓より分離した筋芽細胞にトランスフェクションで導入しジストロフィンの発現を確認する。
DMDでは筋膜でジストロフィン(dy)が欠損しているが筋壊死のメカニズム及びdyの生理作用は未だに不明である。我々はDMDで筋崩壊が起こるメカニズムには血管平滑筋の機能障害に伴う血流異常と血液凝固系の亢進が関与していると考えるに至っている。そこで、mdxマウス血管平滑筋にdyを発現させたトランスジェニックマウス作製し、血管病変に由来する筋壊死の有無を検討すればdyの生理機能についての大きな情報が得られるのではないかと考えた。まず、トランスジェニック作製用のコンストラクトを作製することが必要であるがこの作業にこれまで時間を費やしてきた。手順は以下の通りで、コンストラクト作製に必要な制限酵素、ApaI,SpeI,HindIII,NotI,SalI,EcoRI,PstI,のサイトを持つオリゴDNAを作製する、このオリゴDNAをBluescript II KS-のApaIとPstIで切断したベクターにライゲーションする。その後、そのサイトを利用してSV40のPolyA signal、心臓と平滑筋特異的に発現させる(骨格筋には発現させない)。ヒト平滑筋α-アクチンプロモーター(EA4.7)、ジストロフィンcDNAをライゲーションする。更にに、このコンストラクトが機能するかmdxマウスの心臓より分離した筋芽細胞にトランスフェクションで導入しジストロフィンの発現を確認する。
結論として今年度は、ジストロフィンcDNAを平滑筋のみに発現させることのできるトランスジェニックマウス作製用のコンストラクトを作製することに成功した。
|
-
[Publications] Ogawa M: "The lacZ gene under the control of the 7 kb of human dystrophin muscular specific promoter is expressed in cardiac muscle but not in adult skeletal muscle in transgenic mice."Neuromusc Disord. (in press).
-
[Publications] Fujii I: "Targeted and stable gene delivery into muscle cells by atwo-step transfer system."Biochem Biophys Res Commun. 275. 931-935 (2000)
-
[Publications] Kimura S: "Persistent gene transfer to skeletal muscle mediated by stably tranfered early myogenic progenitor cells."Basic Applied Myol. (in press).
-
[Publications] Lee JY: "Clonal isolationof muscle-derived cells capable of enhancing muscle regeneration and bone healing."J Cell Biol. 150. 1085-1100 (2000)
