デスモヨーキン(AHNAK蛋白)ノックアウトマウスの作成とその機能の解析

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11470186
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Kurume University
• Principal Investigator: 橋本 隆 久留米大学, 医学部, 教授 (20129597)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 目加田 英輔 久留米大学, 分子生命研, 教授 (20135742) ; 名嘉真 武国 久留米大学, 医学部, 講師 (50221453) ; 森 理 久留米大学, 医学部, 助教授 (10175630) ; 伊東 恭悟 久留米大学, 医学部, 教授 (50125499) ; 山田 源 熊本大学, 動物資源開発技術開発部門, 教授 (80174712)
• Keywords: デスモヨーキンケラチノサイト / 細胞接着 / 細胞内情報伝達 / ノックアウトマウス / デスモグレイン / エンボプラキン

Research Abstract

まず、デスモヨーキン(AHNAK蛋白)ノックアウトマウスの作成のための予備研究として、さらに、この蛋白の蛋白レベルでの機能の解析を進めた。デスモヨーキンのN末端・中央部・C末端部のcDNAを組み込んだ有核細胞発現系ベクターを用いた研究で、デスモヨーキンのN末端および中央部は細胞質内に分布し細胞膜および核内への移行は見られなかったが、C末端部には核内および細胞膜部両方への移行が見られた。この反応をtransfection効率をさらに高率にすることにより確認し、さらに、Laser con-focal microscopeを用いた詳細な検討でその分布の変化を明確にした。さらにこのC末端部の細胞内移行反応がカルシウムおよびTPAにより誘導されたことから、この移行にprotein kinase Cを中心とした細胞内情報伝達が重要であることが示唆された。
次いで、デスモヨーキンノックアウトマウスのためのtargeting vectorを作成するためにまず、マウスゲノムDNAライブラリーをマウスデスモヨーキンcDNAによるhybridization screeningを行った。すなわち、以前クローニングしたマウスデスモヨーキンの中央部をコードするcDNAをpBluescript vectorから切り出し、ジゴキシゲニンでラベルした。マウスゲノムDNA Lambda FIXライブラリーと大腸菌XL1Buleで作製したプラークをナイロンメンブランに転写し、DNAハイブリダイゼイションならびに化学発光法により、陽性クローンを得、数回の再スクリーニングで単離した。現在、PCR法、DNA sequencingにより、そのゲノムDNAクローンのintron-exon organizationの解析中である。来年度は、このDNAを用いてTargeting vectorを作成し、ES細胞に導入する予定である。

Research Products

• [Publications] Hirako Y et al.: "Cleavage of BP180(Type XVII collagen) yields a 120kDa collagenous extracellular peptide"J Biol Chem. 273(16). 9711-9717 (1998)
• [Publications] Chan LS et al: "Epitope spreading; lessons from autoimmune skin diseases"J Invest Dermatol. 110. 103-109 (1998)
• [Publications] Nousari HC et al.: "The mechanism of respiratory failure in paraneoplastic pemphigus"N Eng J Med. 340. 1406-1410 (1999)
• [Publications] Nie Z,Hashimoto T: "Complementary peptide against the major epitope in NC16A of BP180 show no spidicificity as vaccines ot bulous pemphigoid"J Dermatol Sci. 21. 157-164 (1999)
• [Publications] Hashimoto T: "Mini-sympsium issue of review articles in the Journal of Dermatological Science-Skin diseases related to abnormality in desmosomes and hemidesmosomes-ediforial review"Dermatol Sci. 20. 81-84 (1999)
• [Publications] Nie Z,Hashimoto T et al.: "C-terminus of Desmoyokin/AHNAK protein is mainly located in the nucleus in low calcium condition,but low to normal calcium shift translocates a part of it to cytoplasm"J Invest Dermatol. (印刷中).
• [Publications] 橋本 隆: "KEY WORD皮膚疾患"先端医学. 210 (1999)
• [Publications] 橋本 隆: "皮膚科診療プラクティス"文光堂. 305 (1999)