ヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入を併用した関節軟骨修復法の開発

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11470299
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 守屋 秀繁 千葉大学, 医学部, 教授 (30092109)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中川 晃一 千葉大学, 医学部・附属病院, 医員 ; 和田 佑一 千葉大学, 医学部・附属病院, 助手 (10282485)
• Keywords: ヒアルロン酸 / 遺伝子導入 / 関節軟骨修復

Research Abstract

1、培養骨膜細胞へのヒアルロン酸合成酵素(HAS)遺伝子導入
純系(NZW;New Zealand White)ウサギの脛骨近位より麻酔下に骨膜組織を採取して細胞を分離培養し、β-galactosidase遺伝子(発現ヘクターpCMVβ)およびmouse HAS遺伝子(pcDNA3-HAS3)をelectroporesion法にて導入した。β-galactosidase遺伝子の発現は4週までみられ、ヒアルロン酸結合蛋白を用いたELISA法にて培養上清中へのヒアルロン酸産生量の増加が確認された。
2、実験的関節軟骨欠損部への骨膜細胞移植
同系のウサギの大腿骨遠位膝蓋大腿関節面に作成した軟骨欠損部に、脛骨近位より自家骨膜を移植し、その下にHAS遺伝子およびβ-galactosidase遺伝子を導入した骨膜細胞を注入し、導入遺伝子の発現の検討を試みた。しかし、この方法だと遺伝子導入した培養骨膜細胞を局所にとどめておくことが困難であった。いくつかの個体ではβ-galactosidase発現細胞が認められたものの、手技的な問題により安定した結果は得られないと判断した。
3、遺伝子銃装置による骨膜組織への遺伝子導入
遺伝子銃装置により直接骨膜組織に遺伝子導入を行うために、まずin vitroで至適条件の検討を行った。同系ウサギより骨膜を採取し、遺伝子銃を用いてβ-galactosidase遺伝子を導入した後、器官培養を行った。金粒子の大きさおよび金粒子あたりのDNA量に関しては従来の研究にてほぼ条件が決定されているので、特に遺伝子導入の際のヘリウムガスの加速度について100〜400psiの範囲で検討した。その結果、遺伝子発現は評価は6週まで認められ、至適導入圧は200psiと考えられた。
現在、遺伝子銃装置によってHAS遺伝子導入を行った骨膜の軟骨組織への分化能について検討中である。

Research Products

• [Publications] 和田佑一、中川晃一: "遺伝子導入を併用した新しい関節軟骨修復法の開発"千葉医学雑誌. 75. 375-376 (1999)
• [Publications] Katsumi A., Wada Y., Moriya H., et al.: "The effects of hyaluronan on periosteal grafts for large full-thickness defects in rabbit articular cartilage"Journal of Orthopedic Science. 4. 127-134 (1999)
• [Publications] 勝見明、和田佑一、中川晃一、守屋秀繁ほか: "家兎関節軟骨損傷に対する骨膜移植時とヒアルロン酸の作用 ー病理学的および生化学的検討ー"臨床リウマチ. 11. 128-134 (1999)