尿路結石におけるオステオポンチンアンチセンスによる遺伝子治療についての基礎的研究

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11470340
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 郡 健二郎 名古屋市立大学, 医学部, 教授 (30122047)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 戸澤 啓一 名古屋市立大学, 医学部, 講師 (40264733) ; 林 祐太郎 名古屋市立大学, 医学部, 助教授 (40238134)
• Keywords: 尿路結石症 / オステオポンチン / 遺伝子治療 / アンチセンス / 細胞接着 / 遺伝子導入 / リポフェクション

Research Abstract

結石マトリクスとして結石形成に重要な役割を担うオステオポンチンを遺伝子治療の標的とすべくいin vitroおよびin vivoの両者で検討した。またin vivoの実験系ではより効率的な遺伝子導入方法を確立すべく導入手技を検討した。
オステオポンチンcDNAをRT-PCR法を用いて作製し、真核細胞発現ベクターにantisense mRNAが発現するように組み込み、サブクローニングした。腎尿細管細胞にtransfectoionしstable発現細胞を確立した。in vitroの結晶付着実験でオステオポンチンantisense RNA安定発現細胞ではオステオポンチンの発現が低下し、結石形成過程のステップの一つであるシュウ酸カルシウム結晶の細胞への付着が抑制されていることを示した。オステオポンチンの発現が結石形成の初期段階である、結晶の細胞への付着に重要であることを確認した。
antisenseオステオポンチン発現ベクターをtransfection試薬と結石モデルラット腎に注入して結石形成とオステオポンチン発現を検討した。mRNA発現が抑制されるのをinsitu hybridizationを用いて明らかにした。結石形成も抑制される傾向にあった。
発現ベクターを(1)直接注入法(2)経動脈的注入法(3)経静脈的注入法(4)経腎孟(逆行性)注入法にてtransfectionを試みた。いずれの方法も一長一短であるが、イヌなどの大きな動物あるいはヒトへの応用を考えると(4)の方法が非侵襲的であり、ベクターの開発でtransfection法として有用であることが推察された。
結石の遺伝子治療の可能性が示唆され、オステオポンチンがその標的遺伝子となりうることを示唆するものであった。

Research Products

• [Publications] Takahiro Yasui, et al.: "Effects of allopurmol on renal stone formation and osteopontin expression in a rat urolithiasis model"Nephron. 87(2). 170-176 (2001)
• [Publications] Takahiro Yasui, et al.: "Effects of citrate on renal stone formation and osteopontin expression in a rat urolithiasis model"Urological Research. 29(1). 50-56 (2001)
• [Publications] Takahiro Yasui, et al.: "Effects of eicosapentaenoic acid on urinary calcium excretion in calcium stone formers"European Urology. 39(5). 580-585 (2001)
• [Publications] Takahiro Yasui, et al.: "Calcium oxalate crystal attachment to cultured rat kidney epithelial cell, NRK-52E"Urologia Internationalis. 67(1). 73-76 (2001)
• [Publications] Takahiro Yasui, et al.: "Osteopontin regulates adhesion of calcium oxalate crystals to renal epithelial cells"Eurolithiasis-9^<th> European Symposium on Urolithiasis. 199-200 (2001)
• [Publications] Keiichi Tozawa, et al.: "Signal transduction mediated by focal adhesion kinase (FAK) and the expression of osteopontin in the renal tubular cells: Role in stone formation"Euxolitbiasis-9^<th> European Symposium on Urolithiasis. 215-216 (2001)