骨や歯の形成、維持機構の解明-低ホスファターゼ症解析によるアプローチ

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11470388
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 織田 公光 新潟大学, 歯学部, 教授 (10122681)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 伊藤 将宏 新潟大学, 歯学部, 助手 (40313522) ; 水野 敞 新潟大学, 歯学部, 助手 (10018426) ; 天谷 吉宏 新潟大学, 歯学部, 助教授 (50193032) ; 大末 和廣 サントリー, 医薬開発研究所, 主席研究員 ; 小林 淳 三重大学, 工学部, 助手 (70242930)
• Keywords: 低ホスファターゼ症 / 石灰化 / 組織非特異型アルカリホスファターゼ / 細胞内輸送 / 小胞体品質管理機構 / グリコシルホスファチジルイノシトール / プロテアゾーム / バキュロウイルス

Research Abstract

1.ヒト組織非特異型アルカリホスファターゼ(TNSALP)に対する特異的な抗体の調製。
TNSALPのC末端側にヒスチジンタグを有する分泌型のTNSALPをコードする組替えバキュロウイルスを構築し、昆虫細胞に感染後に上清からニッケルキレートカラムを用いて分泌型の酵素を大量に精製する方法を開発した。さらに、精製酵素を抗原にして家兎に免疫する事で特異性の高い抗体の調製に成功した。
2.低ホスファターゼ症の患者で報告された(R54C)と(D277A)の2例のミスセンス突然変異型酵素の分子的な欠陥を明らかにした。
野生型酵素のcDNAを鋳型にして部位特異的突然変異法を用いて2つの変異酵素に対応したcDNAを調製し、トランスフェクト後COS-1細胞に一過性に発現した酵素を細胞生物学的に検討した。酵素活性の測定により変異酵素ではその酵素活性が野生型に比べて著しく低下していることが明らかになった。その原因として、変異酵素ではその立体構造の異常により小胞体からの細胞内輸送が著明に阻害されるために細胞表面に到達出来ず、小胞体内で分解されることが判った。さらには、この変異酵素の分解にプロテアソームが関与する知見も得られた。

Research Products

• [Publications] Oda, K., Amaya, Y. et al.: "A general method for rapid purification of soluble versions of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins ---"Journal of Biochemistry. 126. 694-699 (1999)
• [Publications] Izumi, N., Oda, K. et al.: "Ultrastructural alteration of osteoclasts treated with brefeldin A and wortmannin"Acta Histochemistry Cytochemistry. 32. 393-405 (1999)