歯科修復材料-唾液界面において形成されるバイオフィルムの二次齲蝕への関与について

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11470405
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 小西 法文 岡山大学, 歯学部・附属病院, 講師 (60243466)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高務 朋将 岡山大学, 歯学部・附属病院, 助手 (20314700) ; 鳥井 康弘 岡山大学, 歯学部, 助教授 (10188831) ; 井上 清 岡山大学, 歯学部, 教授 (60028727) ; 橋本 武 岡山大学, 歯学部・附属病院, 助手 (30314701)
• Keywords: 抗S.mutans家兎血清 / 蛍光免疫染色 / 共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡 / 染色像 / 付着

Research Abstract

本年度の研究では、レジンおよびエナメル質表面へ付着するStreptococcus mutansを抗S.mutans家兎血清を用いた蛍光免疫染色にて経時的に観察し検討した。
まず、抗S.mutans家兎血清と口腔内細菌(標準菌株)との反応性を酵素免疫吸着法(enzyme-linked immuno sorbent assay:ELISA)により検討した。その結果S.sanguisと強い反応を認めたため、以下のような吸収操作を行った。すなわち、500mlのブレインハートインフュージョン(BHI)液体培地にて一晩培養したS.sanguisを0.9%NaClを含む10mMトリス緩衝液(Tris-saline)で2回洗浄後、同緩衝液に懸濁し遠心して回収した。この菌体に抗血清0.5mlを加え4℃にて12時間静置後、遠心して上清を回収し吸収抗血清とした。得られた吸収抗血清を用いて、蛍光免疫染色により前述の菌株を染色しmutans streptococci以外とは交叉反応しないことを確認した。
In vivoにおける付着実験は以下のように行った。レジンおよびエナメル質試料体を可撤式装置にはめ込みエチレンオキサイドガスにて滅菌後、口腔内に一定時間保持した。これら試料体を滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に移し、その表面に付着した菌を回収した。希釈した懸濁液をスライドガラスにのせ固定後、上記の吸収抗血清を用いて蛍光免疫染色を行い、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡にて観察した。その結果、口腔内に保持後2時間の試料では、染色像を観察できなかったが、8時間後の試料では染色像を観察することができ、24時間後では8時間後の試料よりも広範囲に染色像が認められた。また24時間後の試料では、レジンの方がエナメル質に比べ多くの染色像を認めた。このことから、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡による観察は試料体表面に付着した特定の菌を検出するには簡便な手法であることが示唆された。しかしながら均一に菌をスライドガラスにのせることができないため、全菌に対する特定の菌の割合を正確に分析するのは困難であり、これについては今後検討する予定である。