新規アミノペプチダーゼファミリーの構造とその生物学的意義

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11470492
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 辻本 雅文 理化学研究所, 細胞生化学研究室, 主任研究員 (00281668)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 野村 義宏 東京農工大学, 農学部, 助手 (10228372) ; 松本 英子 理化学研究所, 細胞生化学研究室, 基礎科学特別研究員 (00312257) ; 服部 明 理化学研究所, 細胞生化学研究室, 研究員 (50300893)
• Keywords: アミノペプチダーゼ / 胎盤性ロイシンアミノペプチダーゼ / 脂肪細胞由来ロイシンアミノペプチダーゼ / 神経細胞 / ペプチドホルモン / CHO細胞 / 血圧調節 / タンパク質結晶化

Research Abstract

本年度は脳内に存在する胎盤性ロイシンアミノペプチダーゼ(P-LAP)に関する解析を行なった。その結果、P-LAPは脳内の神経細胞に多く存在すること、神経細胞への分化に伴って発現が上昇すること、細胞内の調節性小胞に存在して分泌刺激によって細胞表面へと速やかに移行すること、ダイノルフィンやMet-エンケファリンなどの神経ペプチドを分解しうることなどを見いだした。
脂肪細胞由来ロイシンアミノペプチダーゼ(A-LAP)をCHO大量発現系を用いて遺伝子組換え型酵素を大量に調製し、これを用いて各種生理活性ペプチドに対する作用の検討を行なった。その結果、A-LAPはP-LAPが基質とするオキシトシンおよびバソプレシンに対しては全く作用を示さなかった。一方、昇圧ホルモンであるアンジオテンシンに対しては非常に効率良く加水分解活性を示し、アンジオテンシンIIからIVへと変換作用を担っていることが明らかとなった。また、A-LAPは降圧ホルモンであるカリジンのN末端からLys残基を遊離してブラジキニンへと変換する活性を有していることも明らかとなった。さらにA-LAPがアンジオテンシン生成酵素である組織カリクレインと同じく腎臓の遠位尿細管に局在していることを免疫組織学的手法にて明らかにした。これら結果から、A-LAPはペプチドホルモン生成あるいは分解作用を介して血圧調節に深く関与している可能性が考えられた。
オキシトシナーゼサブファミリーの立体構造を明らかにする目的で、X線結晶解析に向けてのA-LAPの結晶化の条件検討を行なった。その結果、菱面体のA-LAPの結晶を得ることができたが、回折実験では高分解能の反射が得られなかった。そのため次年度は、結晶化条件の更なる検討あるいは糖を除いたタンパク質の調製などを行なうことで、高分解能の反射が得られるような結晶の作製さらには立体構造の解明を行なう予定である。

Research Products

• [Publications] Matsumoto H., et al.: "Characterization of recombinant soluble form of human placental leucine aminopeptidase/oxytocinase expressed in Chinese hamster ovary cells"Eur.J.Biochem.. 267. 46-52 (2000)
• [Publications] Nakanishi Y., et al.: "Immunoaffinity purification and characterization of native placental leucine aminopeptidase/oxytocinase from human placenta"Placenta. 21. 628-634 (2000)
• [Publications] Hattori A., et al.: "Characterization of recombinant human adipocyte-derived leucine aminopeptidase expressed in Chinese hamster ovary cells"J.Biochem.. 128. 755-762 (2000)
• [Publications] 服部明,辻本雅文: "アミノペプチダーゼをめぐる最近の話題"ファルマシア. 36. 865-869 (2000)