フローサイトメトリーを用いた血小板活性化測定法の確立

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11470515
• Research Institution: HOKKAIDO UNIVERSITY
• Principal Investigator: 松野 一彦 北海道大学, 医療技術短期大学部, 教授 (70102332)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 千葉 仁志 北海道大学, 医学部・附属病院, 講師 (70197622)
• Keywords: 血小板 / フローサイトメトリー / CD62P / CD63 / PAC-1 / CD36 / 酸化LDL

Research Abstract

血小板は動脈血栓症の発症や動脈硬化の伸展に関与しており、生体内の血小板活性化の状態を知ることは血栓症発症の予知などに有用と考えられる。最近、血小板活性化の測定に血小板表面への活性化抗原の発現をフローサイトメトリー(FCM)法にて解析する方法が応用されているが、採血法、抗凝固剤の選択、固定時期、活性化抗原の選択などその測定方法は一定していない。今回、FCM法を用いた血小板活性化測定法の確立を目的として、基礎的検討および臨床応用について検討した。In vitroの検討では、活性化のマーカーとしてα顆粒由来のCD62P、ライソゾーム顆粒由来のCD63および活性化時のGPIIb/IIIa複合体を認識するPAC-1抗体が最も感度良く活性化を捉え、次いでライソゾーム顆粒に存在するLAMP-1、LAMP-2に対する抗体である抗CD107aおよびCD107b抗体も活性化を認識したが、トロンビンレセプター抗体であるSPAN12およびWADE15抗体では十分な活性化の把握は出来なかった。採血直後に固定あるいは直後にMoAbを添加した後に固定する必要があるが、ルーチン検査とともに採血する場合にはEDTAなどの抗凝固剤にPGE1やテオフィリンなどの抗血小板剤が混和されたもので採血すると採血後の活性化抗原の発現を抑制することができた。採血した直後に固定した未刺激の全血を用いてFCM法にてCD62P、CD63、PAC-1の発現をみると、健常群と比較し慢性透析群などの生体内の強い血小板活性化が疑われる群では有意に発現の増加がみられたが、糖尿病、高脂血症などの群では3抗原とも発現の増加傾向はみられるが統計学的に有意ではなかった。しかしながら、これらの群ではADPあるいはコラーゲン刺激後のCD62P、CD63、PAC-1の発現は有意に増加していた。CD36欠損群では酸化LDL刺激後のCD62P、CD63の発現は亢進し、未刺激全血でのCD62P、CD63、PAC-1の発現も増加傾向を認めた。

Research Products

• [Publications] Yanai H,: "Human CD36 deficiency is associated with elevation in low-density lipoprotein-cholesterol."Am J Med Gen. 93. 299-304 (2000)
• [Publications] Yanai H: "Type I CD36 deficiency in humans is not associated with insulin resistance syndrome."Thromb Haemast. 83・5. 786 (2000)
• [Publications] Yanai H.: "Phenotype-genotype correlation in CD36 deficiency Type I and II."Thromb Haemost. 84・3. 436-441 (2000)
• [Publications] 松野一彦: "血小板の分子マーカー"Vita. 17・3. 69-73 (2000)