2000 Fiscal Year Annual Research Report
急速凍結フリーズレプリカ法を駆使した滑り運動中のダイニン分子の高分解能構造解析
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11480185
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
片山 栄作 東京大学, 医科学研究所, 助教授 (50111505)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
真行寺 千佳子 東京大学, 大学院・理学系研究科, 助教授 (80125997)
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| Keywords | 急速凍結電子顕微鏡法 / ディープエッチ・レプリカ法 / 3次元像再構成 / ダイニン / 微小管 / コンピュータ・シミュレーション / コンフォメーション変化 / 酢酸ウラニル固定 |
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| Research Abstract |
本研究は、高い時間・空間分解能を有する急速凍結ディープエッチ・レプリカ電子顕微鏡法により、これまで詳細な構造解析がほとんど試みられていないダイニン・微小管複合体の3次元構造と、滑り運動中の構造変化とを明らかにすることを目指す。研究は、生物材料を急速凍結してレプリカ試料を観察する過程と、得られた画像からその3次元構造を再構成する手法の開発とに分けられる。後者に関しては、既に多くの画像データの蓄積があるアクトミオシン系を試験材料として仕事を進めた。電子線照射に強いレプリカの特長を生かし、電子顕微鏡内で試料を傾斜して撮影した同一視野の多数の像において、多くの特徴点の高さを立体視差測定法により精密計測した。従来の逆投影法による再構成は撮影角度範囲の制限のために高さ方向の分解能が著しく低く、また多くのゴースト像を含むが、前記別法で得られた高さのデータを重ねることにより無効な濃度領域を取り除き、目標とする3次元構造を求めることが可能となった。現在、更に方法を改良し、すべての濃度情報を有効に用いる新手法を開発中である。一方、原子座標が既知の対象に関して、原子モデルのコンピュータシミュレーションにより、どのようなレプリカ像が見えるかを的確に推定する技術を開発した。前記の再構成法にこれを併用してフィードバックをかけることで再構成像の信頼性を更に上げることができる。急速凍結フリーズレプリカ法に併用するマイカ細片法では試料を観察できる範囲がかなり狭く、実験操作中の試料の像を得ることは大変難しい。そこで、分解能を多少犠性にしても、ずっと広範囲の像を捉えられる新たな方法を追求した。酢酸ウラニルの固定作用はほぼ20msecと思いのほか速かったので、以前発表された、酢酸ウラニル固定した試料にロータリーシャドウィングを施す方法を改変し、機能中のダイニン・微小管複合体の構造の解析に応用を試みる所存である。
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[Publications] Yamane,K.: "Retinoblastoma susceptibility protein, pRb, possesses multiple BRCT- Ws, BRCA1carboxyl-terminus-related W regions with DNA break-binding activity"Oncogene. 19(16). 1982-1991 (2000)
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[Publications] Tamano,K.: "Supramolecular structure of Shigella type III secretion machinery : the needle part is changeable in length and essential for delivery of effectors"EMBO Journal. 19(15). 3876-3887 (2000)
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[Publications] Utsunomiya-Tate,N.: "Reelin molecules assemble together to form a large protein complex, which is inhibited by the function-blocking CR-50 antibody"Proceedings of National Academy of Science U.S.A.. 97(17). 9729-9734 (2000)
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[Publications] Yamane,K.: "The BRCT Regions of Tumor Suppressor BRCA1 and of XRCC1 show DNA end binding activity with a multimerizing feature"Biochemical and Biophysical Research Communications. 279(2). 678-684 (2000)
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[Publications] Yamane,K.: "p53 contains a DNA break-binding motif similar to the functional part of BRCT-related region of Rb."Oncogene. (in press). (2001)
