大腸菌のDNA複製開始タンパクDnaAの活性制御に関する研究

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11480202
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 関水 和久 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 教授 (90126095)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 久保 健雄 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 助教授 (10201469)
• Keywords: 大腸菌 / DNA複製開始 / DnaA / ATP / ATPase / RIDA / 複製フォーク / リン脂質

Research Abstract

本研究は、大腸菌のDNA複製開始蛋白DnaAの活性制御機構を明らかにすることにより、DNA複製の制御機構を理解することを目的としたものである。すでに研究代表者らは、DnaA蛋白がATPに対して高い親和性を有すること、ATP結合型DnaA蛋白は、それ自身のATPasc活性により、不活性なADP結合型となること、及び、複製酵素であるDNAポリメラーゼIIIホロ酵素がDnaA蛋白に結合したATPの加水分解を促進することを明らかにしてきた。本研究では、DNAポリメラーゼIIIホロ酵素以外のDnaA蛋白のATPaseを促進する因子の検索と精製を試みた。これを実行するために、^<32>Pで放射標識した細胞から、抗体を用いてDnaA蛋白を回収し、細胞内でDnaA蛋白に結合したアデニンヌタレオチドを分析する方法を確立した。さらに、様々なDNA複製の温度感受性変異株を用いた実験により、複製のフォーク進行に関わる蛋白が細胞内でのこの反応に預かることを明らにした。また、試験管内でのDnaA蛋白のATPase活性促進因子として、すでに研究代表者らがRIDAと命名していた分画についても、精製することに成功した。さらに、本研究では、抗体と共沈した放射標識されたリン脂質を分析することにより、細胞内でDnaA蛋白に結合しているリン脂質を明らかにする方法を確立した。その結果、すでに試験管内でDnaA蛋白質を活性化することを研究代表者らが示しているカルジオリピン及びフォスファチジルグリセロールが、抗原抗体複合体として回収されることが示された。この結果は、細胞内でDNA複製開始蛋白DnaAが酸性リン脂質と結合していることを直接示す初めての例である。

Research Products

• [Publications] Kenji Kurokawa: "Replication cycle-coordinated change of the adenine nucleotide-bound forms of DnaA protein in Escherichia coli"The EMBO Journal. 18・23. 6642-6652 (1999)
• [Publications] Tsutomu Katayama: "Inactivation of Escherichia coli DnaA protein by DNA polymerase III and negative regulations for initiation of chromosomal replication"Biochimie. 81. 835-840 (1999)
• [Publications] Nobuyoshi Akimitsu: "Increase in Resistance of Methicillln-Resisiant Staphylococcus aureus to β-Lactams Caused by Mutations Conferring Resistance to Benzalkonium Chioride,a Disinfectant Widely Used in Hospitals"ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY. 43・12. 3042-3043 (1999)
• [Publications] Makoto Takata: "Mutant DnaA proteins defective in dupiex opening of oriC,the origin of chromosomal DNA replication in Escherichia coll "Molecular Microbiology. 35・2. 454-462 (2000)
• [Publications] Taemi KONDO: "Suppression of temperature-sensitivity of a dnaA46 mutant by excessive DNA supercoiling"Biochem.J.. 348. 375-379 (2000)