2000 Fiscal Year Annual Research Report
蛋白質分子間認識の細胞内1分子計測法の開発と細胞内情報伝達研究への応用
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11480210
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
佐甲 靖志 大阪大学, 医学系研究科, 助教授 (20215700)
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| Keywords | 全反射顕微鏡 / MAPK経路 / 細胞増殖 / 構造搖らぎ / リン酸化 / 成長因子 / 蛍光励起エネルギー移動 |
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| Research Abstract |
生きている細胞中で蛋白質1分子を画像として検出し、それらの相互作用を計測する方法を開発し、その方法を、細胞内情報伝達反応における分子間認識の測定に応用することが本研究の目的である。本研究では、先に細胞内1分子可視化法と、分子間相互作用の1分子検出法の開発を行ったが、今年度はこれらの方法を用いて、以下の細胞内情報伝達過程の計測を行った。
(1)EGFの結合とEGF受容体の2量体化の測定
EGF分子と細胞膜のEGF受容体の結合反応は、すでに1分子計測が可能である。蛍光色素Cy3で標識したEGFとCy5で標識したEGFを同時に細胞膜に結合させ、Cy3-EGFからCy5-EGFへの蛍光励起エネルギー移動によって、EGF受容体の2量体化の反応を測定した。
EGFの結合から数分の間にエネルギー移動をしめす輝点の数が増加することがわかった。一方でEGFの結合時点ですでに受容体がクラスターをつくっていることがわかっており、EGFの結合によってクラスターの構造変化が起こることが示唆された。また、受容体の2量体間のエネルギー移動効率は秒のオーダーで揺らいでおり、受容体の相互作用にゆっくりした変化が起こっていることがわかった。
2)RasとRaf-1の相互作用の細胞内測定
Ras-GTPとRaf-1-YFPの間の相互作用を、GFPからYFPへの蛍光励起エネルギー移動の測定により測定した。EGF刺激により、Raf-1は細胞質から細胞膜に移行し、Rasと結合すると考えられている。エネルギー移動の計測から、細胞膜でRasとRaf1が直接相互作用していること、EGFによって形成される葉状仮足や微笑突起では特にRasとRaf1の共局在が著しく、両者の直接相互作用が見られることが明らかになった。
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[Publications] Y.Sako,S.Minoguchi & T.Yanagida: "Single-molecule imaging of EGFR signalling on the surface of living Cells"Nature Cell Biology. 2. 168-172 (2000)
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[Publications] Y.Sako,K.Hibino,T.Miyauchi,Y.Miyamoto,M.Ueda & T.Yanagida: "Single-Molecule Imaging of Signaling Molecules in Living Cells"Single Molecules. 1. 159-163 (2000)
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[Publications] F.Kano,Y.Sako,M.Tagaya,T.Yanagida.& M.Murata: "Reconstitution of brefeldin A-induced Golgi-tubulation and its fusion with the ER in semi-intact CHO cells"Mol.Biol.Cell.. 11. 3073-3087 (2000)
