メタノール誘導性スーパープロモーターの開発と異種有用タンパクの生産

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11556015
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 阪井 康能 京都大学, 大学院・農学研究科, 助教授 (60202082)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 近藤 恵二 キリンビール株式会社, 基盤技術研究所, 主任研究員 ; 由里本 博也 京都大学, 大学院・農学研究科, 助手 (00283648) ; 加藤 暢夫 京都大学, 大学院・農学研究科, 教授 (50026556)
• Keywords: メタノール資化性酵母 / Candida boidinii / アルコールオキシダーゼ / ジヒドロキシアセトンシンターゼ / ギ酸デヒドロゲナーゼ / メタノール誘導性プロモーター / ペルオキシソーム / Pichia methanolica

Research Abstract

メタノール資化性酵母(Candida boidiniiのアルコールオキシダーゼ遺伝子(AOD1)、ジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子(DASI)、ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(FDHI)のプロモーターはいずれも強力なメタノール誘導性プロモーターであるが、その詳しい遺伝子活性化機構や強さの評価については知られていなかった。そこで、それぞれのプロモーターの特徴を明らかにするために、出芽酵母酸性フォスファ-タ-ゼ遺伝子をレポーターとして各プロモーターの強さの発現調節を解析したところ、メタノール誘導時の強さはDAS1プロモーター、AOD1プロモーター、FDH1プロモーターの順であり、FDH1プロモーターはギ酸によっても活性化され、グルコース抑制を受けないことなどが分かった。また、Pichia methanolicaでは、2つのアルコールオキシダ-ゼ遺伝子MOD1,MOD2が存在するが、それぞれの遺伝子は、メタノール濃度に呼応して発現されることを明らかにした。
一方、メタノール資化性酵母において顕著に発達するペルオキシソームに有用毒性タンパク質を閉じこめて、効率よく集積するための技術を確立した。宿主としAOD1遺伝子破壊株(aod1Δ株)を用い、グリセロールを炭素源、メタノールを誘導源、メチルアミンを窒素源として用いると最高の生産性が得られることがわかった。このことを契機として、aod1Δ株を用いてAOD1プロモーターの発現制御を解析したところ、メタノールのみでは野性株よりも弱い誘導しか得られず、メチルアミン添加によって生じるホルムアルデヒドやそれ以降の代謝産物により強い誘導を受けることが示唆された。現在、各種メタノール代謝酵素遺伝子破壊株を用いて、各プロモーターの様々な誘導基質に対する応答を調べることにより、真の誘導物質の特定と各誘導基質に対するcis-elementの同定を行っている。

Research Products

• [Publications] Y.Sakai: "Biotechnological application of cellular functions of the methylotrophic yeast"J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. 6. 161-173 (1999)
• [Publications] T.Nakagawa: "Alcohol oxidase hybrid oligomers formed in vivo and in vitro"Yeast. 15. 1223-1230 (1999)
• [Publications] Y.Sakai: "Production of fungal fructosyl amino acid oxidase useful for diabetic diagnosis in the peroxisome of Candida boidinii"FEBS Lett.. 459. 233-237 (1999)
• [Publications] 由里本 博也: "メタノール資化性酵母による異種遺伝子発現"化学と生物. (印刷中). (2000)
• [Publications] 阪井 康能: "糖尿病診断に有効な微生物由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ ―酵素の性質とメタノール酵母を用いる大量生産―"日本臨床化学会 九州支部会誌. (印刷中). (2000)