エピトープタグを利用した新規遺伝子ターゲティング法の開発と組換え動物作出への応用

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11556064
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Iwate University
• Principal Investigator: 森松 正美 岩手大学, 農学部, 助教授 (70241370)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 吉松 組子 北海道大学, 医学部, 助手 (90220722) ; 小川 和重 岩手大学, 農学部, 助教授 (60231221) ; 首藤 文榮 岩手大学, 農学部, 教授 (60001533) ; 吉村 佳典 株式会社 エイアンドティー, 試薬開発グループ, マネージャー ; 三好 一郎 東北大学, 医学部, 助手 (10183972)
• Keywords: エピトープタグ / 標的遺伝子組換え / 遺伝子機能解析 / マウス / 分子間相互作用 / 細胞内局在

Research Abstract

本研究の目標は,従来の主流であったノックアウト解析ではなく,ノックインにより,哺乳動物に存在しない特異的な目印(エピトープタグ)を標的分子に導入し,生体反応におけるその動向を抗エピトープタグ抗体で調べる方法を開発・実用化することである.本年度は,乳癌遺伝子産物(Brca2)およびエンドトキシン誘導性新規遺伝子(MAIL)をモデル標的遺伝子として研究に着手した.
1.乳癌遺伝子産物(Brca2)を標的とした検討
タグ導入法の検討を行った.まず,マウスBrca2のゲノムをポジティブ・ネガティブ選別が可能なhprtカセッテとつなぎ,二段階置換法によるターゲティングベクターを構築した.この際,二段階目のベクターにはHAエピトープの配列を導入した.また,二段階目のベクターへの置換が効率よく行われるように,ISce-Iの認識配列を導入して二重鎖切断を誘導しながら組換えを起こすことを考えた.本年度はベクターを構築する作業まで進むことができた.
2.エンドトキシン誘導性新規遺伝子(MAIL)を標的とした検討
MAILは代表者らが初めて分離・同定した遺伝子であり,各種炎症性痴患疾患等において重要な役割を果たすその局在等はまだ分かっていない.本研究では,新たにマウスのMAILについて,ファージおよびBACライブラリーよりゲノムクローンを単離した.制限酵素地図を作製するとともに塩基配列を読解し,ターゲティングベクターの構築に取り組んだ.
3.新規エピトープタグの開発
多分子間の結合を調べるためには,エピトープタグが多数必要である.そのため,市販のタグに加え,新規にハンタウイルスよりエピトープタグを開発することを計画した.抗ハンタイウルス抗体を産生するハイブリドーマを培養して抗体を分離し,これを標識して抗体の特異性を調べるとともにエピトープ領域の絞り込みを行った.

Research Products

• [Publications] Watamabe,Y.ら: "Botulinum C3 enzyme changes the lactate dehydrogenase isozyme pattern of primary culture of neurons"Journal of Veterinary Medical Science. (印刷中). (2000)
• [Publications] Watamabe,Y.ら: "The evaluation of the potential of botulinum C3 enzyme as an exogenous differentiation-inducing factor to neurons"Journal of Veterinary Medical Science. (印刷中). (2000)
• [Publications] Suzuki,K.ら: "Molecular characterization of airborne odorant receptor organ specific protein in Xenopus laevis daudin"Animal Biochemistry. 36管1号. (1999)