蛋白質間相互作用を利用した細胞内シグナル伝達分子の同定法の開発

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11557015
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 宮園 浩平 東京大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (90209908)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 今村 健志 (財)癌研究会, 癌研究所生化学部, 主任研究員 (70264421)
• Keywords: TGF-β / シグナル伝達 / 蛋白質間相互作用 / マススペクトロメトリー / Smad

Research Abstract

蛋白質-蛋白質問の相互作用による細胞内シグナル伝達機構を明らかにするためにTGF-βのシグナル伝達分子であるSmadに結合する蛋白質をマススペクトロメトリーで同定しすることを目的として実験を行った。Smad1〜8にFlagをつけたコンストラクトを作り哺乳類細胞にトランスフェクションした。ついでアガロースビーズに結合したFlagやMyc抗体を用いて蛋白質を免疫沈降し、共沈する蛋白質を銀染色したSDS-PAGEから切りだし、トリプシン処理したのち、マススペクトロメトリーによってペプチドの質量を測定した。その結果、哺乳類細胞の中ではCOS7細胞が293細胞などよりトランスフェクション効率が高く、再現性の高い結果が得られた。stableにトランスフェクションしたものよりtransientにトランスフェクションしたものの方が多くのタンパク質が得られた。こうした結果をもとにSmad1と結合するタンパク質を調べたところ、Rabファミリーのタンパク質がSmad1と結合することが明らかとなった。two-hybrid screeningでもRab様タンパクが結合することが確認されたことから、得られたRabファミリーを加えてSmad1とのCOS7での結合を確認した。その結果、リガンド刺激非存在下で、Smad1とRabファミリータンパクが結合することが明らかとなった。また共焦点顕微鏡で確認したところ細胞内で両者が共存することが明らかとなり、本法の有用性が確認された。

Research Products

• [Publications] Miyazono,K.,ten Dijke,P.,and Heldin,C.-H.: "TGF-b signaling by Smad proteins."Adv.Immunol.. 75. 115-157 (2000)
• [Publications] Miyazono,K.: "TGF-b signaling by Smad proteins."Cytokine Growth Factor Rev.. 11(1-2). 15-22 (2000)
• [Publications] Miyazono,K.: "Positive and negative regulation of TGF-b signaling."113(7). 1101-1109 (2000)
• [Publications] Miyazono,K.,Kusanagi,K.,and Inoue,H.: "Divergence and convergence of TGF-b/BMP signaling."J.Cell.Physiol.. (in press). (2001)