クローン技術の応用による動脈硬化研究のためのトランスジェニックウサギの開発

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11557016
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 渡辺 照男 筑波大学, 基礎医学系, 教授 (40037396)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 本田 一男 山之内製薬, 筑波研究所, 薬理研究所長 ; 井出 良浩 筑波大学, 基礎医学系, 講師 (70258606) ; 范 江霖 筑波大学, 基礎医学系, 講師 (60272192) ; 長崎 比呂央 明治大学, 農学部, 助教授 (50318664)
• Keywords: 遺伝子操作 / ウサギ / クローンウサギ / 体細胞クローン / 細胞核融合 / 動脈硬化 / リポ蛋白 / 動物モデル

Research Abstract

ヒトアポ(a)トランスジェニックウサギの胎仔細胞核の移植によるトランスジェニックウサギの作製を目的に、基本的な技術の確立を行った。(1)ウサギ卵子の採取法:妊娠馬血清並びにヒトHCGを使用し、雌ウサギに対する過剰排卵法を確立した。(2)至適培地の選定:卵子をヒアルロニダーゼ処理し、卵丘細胞を除去した。至適培地として、M199、Supplemented EBSS、CMRL1064、KOMENを選定し、FCSまたはES細胞用子牛血清(ES-CS)を添加して使用。(3)胚子の発達:培養下での単為生殖胚の発達を検討したところ、細胞質の表現型に2型、つまり淡明で均質な細胞質を持つ胚と顆粒状細胞質を持つ胚に大別されることが判明した。(4)核移植並びに細胞融合法に関する検討:卵子をサイトカラシンBで処置し、極体とその直下の細胞質を含む中期板を吸引除去した後、胎児皮膚線維芽細胞核を透明帯直下に移入した。これら2つの細胞を電気刺激により融合し、活性化するための条件について検討した。細胞融合の条件として200〜300Vの電圧下に種々検討を行った結果、220〜240Vのパルス電流の60μsec、1〜4回照射により良好な結果を得た。以上の基本的な検討結果を踏まえ、現在、細胞融合し活性化した"胚子"を24時間培養した後、偽妊娠させた雌ウサギの卵管内に移植し、胎内における分裂増殖能力についての検討を行っている。

Research Products

• [Publications] Fan,J, and Watanabe,T: "Human apo(a) transgenic rabbit, as auseful model for the syudy of human Lp(a)"Annual of New York Acad Sci. (in press). (2000)
• [Publications] Fan,J, Iwasa,S, and Watanabe,T: "Role of endothelin in atherosclerosis"Annual of New York Acad Sci. (in press). (2000)