2001 Fiscal Year Annual Research Report

クローン技術の応用による動脈硬化研究のためのトランスジェニックウサギの開発

Research Project

Project/Area Number	11557016
Research Institution	SAGA MEDICAL SCHOOL
Principal Investigator	渡辺照男佐賀医科大学, 副学長 (40037396)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	本田一男山之内製薬, 筑波研究所, 薬理研究所長范江霖筑波大学, 基礎医学系, 講師 (60272192) 木本雅夫佐賀医科大学, 医学部, 教授 (40153225)
Keywords	体細胞核移植技術 / クローンウサギ / トランスジェニックウサギ / 単為発生 / 卵細胞活性化 / 動脈硬化 / リポ蛋白 / 動物モデル
Research Abstract	体細胞核移植技術を用いたクローンアポ蛋白(a)トランスジェニック[apo(a)Tg]ウサギの作製を目指して以下の基礎的技術の検討を行い、卵子の体外発生および活性化に関わる因子などを検討した。電気融合法による核移植: (1)ウサギ未受精卵子の単為発生における至適培地を検討するため、未受精卵細胞を電気刺激により活生化後種々の培地で培養した。培養7日後において桑実胚あるいは胚盤胞を形成した割合を指標に至適培地を検討したところ、ES細胞培養用に調製された培地および血清を用いると,81.5%の卵細胞が桑実胚あるいは胚盤胞を形成した。 (2)apo(a) Tgウサギ胎仔より繊維芽細胞を分離、培養した。繊維芽細胞におけるapo(a)遺伝子の発現は、ゲノムDNAを用いたPCR法により確認した。hCG注射後15〜17時間後に未受精卵子を採取し、Hoechst33342で染色後、蛍光顕微鏡下で第2減数分裂中期の染色体を吸引除去した。次に無血清培地下で3日間培養したドナー細胞を卵腔内に注入し電気刺激により細胞融合・活性化を行った。調製した融合細胞(415個)を12羽偽妊娠させた雌ウサギの卵管内に移植したが、出産できるまでにはまだ至らない。現在、3週間後に帝王切開を行うことにより胎仔が作製されるかどうかを検討中である。ピエゾマイクロインジェクション法による核移植: 新しい方法として、ピエゾドライブにより直接核の注入を行った。168個の卵子とl10個の核移植した胚を用いて、塩化ストロンチウムで活性化させた後、細胞の分裂状態を評価した。3日後の細胞分裂を観察した結果、桑実胚が形成される割合はそれぞれ83%と9%であった。また、PMS/hCGの注射時間と極体との関係も検討した。もっとも良いPMS/hCG注射時間は72時間で、79%の卵子の極体が染色体の直下に存在していた。今後は、この方法で核移植を進めていくこと考えている。

Research Products

(6 results)

All Other

All Publications (6 results)

[Publications] Ichikawa, T., Shimoyamada, H., Unoki, H., Sun, H., Shikama, T., Watanabe, T., Fan, J.: "Lipoprotein(a) promotes smooth muscle cell proliferation and dedifferentiation in atherosclerotic lesions of human apo(a) transgenic rabbits"Am J.Pathol.. 160. 227-236 (2002)
[Publications] Fan, J., Unoki, H., Kojima, N., Sun, H., Shimoyamada, H., Watanabe, T.: "Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits inhibits diet-induced hypercholesterolemia and atherosclerosis"J.Biol.Chem.. 276. 40071-40079 (2001)
[Publications] Fan, J., Sun, H., Unoki, H., Shiomi, M., Watanabe, T.: "Enhanced atherosclerosis in Lp(a) WHHL transgenic rabbits"Ann New York Acad.Sci.. 947. 362-365 (2001)
[Publications] Fan, J., Shimoyamada, H., Sun, H., Marcovina, S., Watanabe, T.: "Transgenic rabbits expressing human apolipoprotein(a) develop enhanced atherosclerotic lesions in response to cholesterol-rich diet"Arteriosci.Thrormb.Vascul.Biol.. 21. 88-94 (2001)
[Publications] Wu, L., Tanimoto, A., Murata, Y., Fan, J., Sasaguri, Y.Watanabe, T.: "Induction of human metalloproteinase-12 gene transcritional activity by GM-CSF requires the AP-1 binding site in human U937 monocytic cells"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 285. 300-307 (2001)
[Publications] Iwasa, S., Fan, J., Miyauchi, T., Watanabe, T: "Blokade of endothelin receptors reduces diet-induced hypercholesterolemia and atherosclerosis in apoE-deficient mice"Pathobiology. 69. 1-10 (2001)

2001 Fiscal Year Annual Research Report

クローン技術の応用による動脈硬化研究のためのトランスジェニックウサギの開発

Principal Investigator

渡辺 照男 佐賀医科大学, 副学長 (40037396)

Research Products

[Publications] Ichikawa, T., Shimoyamada, H., Unoki, H., Sun, H., Shikama, T., Watanabe, T., Fan, J.: "Lipoprotein(a) promotes smooth muscle cell proliferation and dedifferentiation in atherosclerotic lesions of human apo(a) transgenic rabbits"Am J.Pathol.. 160. 227-236 (2002)

[Publications] Fan, J., Unoki, H., Kojima, N., Sun, H., Shimoyamada, H., Watanabe, T.: "Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits inhibits diet-induced hypercholesterolemia and atherosclerosis"J.Biol.Chem.. 276. 40071-40079 (2001)

[Publications] Fan, J., Sun, H., Unoki, H., Shiomi, M., Watanabe, T.: "Enhanced atherosclerosis in Lp(a) WHHL transgenic rabbits"Ann New York Acad.Sci.. 947. 362-365 (2001)

[Publications] Fan, J., Shimoyamada, H., Sun, H., Marcovina, S., Watanabe, T.: "Transgenic rabbits expressing human apolipoprotein(a) develop enhanced atherosclerotic lesions in response to cholesterol-rich diet"Arteriosci.Thrormb.Vascul.Biol.. 21. 88-94 (2001)

[Publications] Wu, L., Tanimoto, A., Murata, Y., Fan, J., Sasaguri, Y.Watanabe, T.: "Induction of human metalloproteinase-12 gene transcritional activity by GM-CSF requires the AP-1 binding site in human U937 monocytic cells"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 285. 300-307 (2001)

[Publications] Iwasa, S., Fan, J., Miyauchi, T., Watanabe, T: "Blokade of endothelin receptors reduces diet-induced hypercholesterolemia and atherosclerosis in apoE-deficient mice"Pathobiology. 69. 1-10 (2001)

渡辺照男佐賀医科大学, 副学長 (40037396)