光老化モデルマウスの開発:エラスチン・プロモーター/蛍光蛋白発現遺伝子導入線維芽細胞による紫外線障害の迅速診断

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11557062
• Research Institution: Hirosaki University
• Principal Investigator: 今 淳 弘前大学, 医学部・附属病院, 講師 (60271798)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 玉井 克人 弘前大学, 医学部, 助教授 (20236730)
• Keywords: 光老化 / エラスチンプロモーター / solar elastosis / 紫外線 / 線維芽細胞 / サンスクリーン

Research Abstract

1)ヒトエラスチンプロモーター遺伝子が挿入された蛍光タンパク質GFP発現ベクターの調製:
ヒト末梢血液からヒトゲノムDNAを抽出し,これをテンプレートとして用いて,polymerase chain reaction(PCR)法にて,840bpのヒトエラスチンプロモーター領域を増幅した。次いでこれを蛍光タンパク質GFPの発現ベクターにサブクローニングして,ヒトエラスチンプロモーター遺伝子の挿入されたGFP発現ベクター(ヒトエラスチンプロモーター遺伝子-GFP発現ベクター)を調製した。
2)ヒトエラスチンプロモーター遺伝子-GFP発現ベクターのマウス線維芽細胞への導入:1)で調製したヒトエラスチンプロモーター遺伝子-GFP発現ベクターをマウス線維芽細胞にリポソーム法(DOTAP法)によって導入した。次いで,細胞を紫外線UVB(20mJ/cm^2,40mJ/cm^2)で照射し,GFPの発現量の変化を調べた。その結果,UVB照射によって蛍光タンパク質GFPの蛍光強度が増強していた。
3)ヒトエラスチンプロモーター遺伝子-GFPがstableに導入されたマウス線維芽細胞の調製:2)の結果を踏まえて,2)と同様の方法で,ヒトエラスチンプロモーター-GFP発現ベクターをマウス線維芽細胞に導入した。次いでこの細胞から,ネオマイシン(G418)を培地中に添加することによって,遺伝子が導入された細胞のみを選択した。そして継代を繰り返した結果,最終的にはすべての細胞が遺伝子の導入されたものとなった。
4)紫外線UVBによる蛍光タンパク質GFP発現の変化の解析:3)で調製した細胞に同様にして紫外線UVBを照射し,その発現量を比較した。その結果,UVB照射によって蛍光タンパク質GFPは著明に増強した。そこで次にこの細胞を実際に弘前ヘアレスラット皮膚に注入し,同様にUVBを照射したところ,GFPの発現がin vivoにおいても増強することを確認した。