細胞制御遺伝子を用いた造血幹細胞改変技術の開発と応用

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11557075
• Research Institution: Jichi Medical School
• Principal Investigator: 小澤 敬也 自治医科大学, 医学部, 教授 (30137707)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 長谷川 護 ディナベック研究所, 所長 ; 久米 晃啓 自治医科大学, 医学部, 助教授 (10264293)
• Keywords: 造血幹細胞 / 体内増幅 / 体外増幅 / 遺伝子導入 / 分化制御遺伝子 / 選択的増幅遺伝子

Research Abstract

1.造血幹細胞の体外増幅のための分化制御遺伝子の開発とその解析:分化抑制活性を持つと考えられるドミナントネガティブレチノイン酸受容体α遺伝子(RAR-E遺伝子)とネオマイシン耐性遺伝子(neo)をIRESで連結し、loxP配列で挟んだ後、レトロウイルスベクターに搭載した。導入遺伝子の除去法については、Creリコンビナーゼを作用させてloxP間の組換え反応を起こさせ、その間に挟まれた分化制御遺伝子を取り外すという実験を行った。Creの発現法としては、発現制御装置を連結したCre遺伝子を分化抑制遺伝子と同じベクターに組み込む一段法と、Cre発現レトロウイルスベクターを後から導入する二段法の両者について検討した。前者はまだ成功していないが、後者の方法ではRAR-E遺伝子の取り外しが可能であった。IL-3依存性32Dcl3細胞を用いたモデル実験系で、分化制御がうまく行くことを確認した。
2.遺伝子導入造血幹細胞の体内増幅のための選択的増幅遺伝子の開発とその解析:選択的増幅遺伝子(G-CSF受容体/タモキシフェン受容体ホルモン結合領域のキメラ蛋白質をコードする遺伝子)の評価を中心に進めた。まず、レトロウイルスベクターで選択的増幅遺伝子を導入した骨髄細胞により致死量放射線照射マウスの造血系を再構築した。次に、このマウスにタモキシフェンを短期間投与し、その前後で末梢血を採取し、導入遺伝子を含む成熟血球の比率をフローサイトメトリー法により検討した。その結果、一時的ではあるが、遺伝子導入した血球が体内で増幅することを確認できた。

Research Products

• [Publications] Kanazawa,T.: "Gamma rays enhance rAAV-mediated transgene expression and cytocidal effect of AAV-HSVtk/ganciclovir on cancer cells."Cancer Gene Ther.. (in press).
• [Publications] Shinjyo,T.: "Downregulation of Bim, a proapoptotic relative Bcl-2, is a pivotal step in cytokine-initiated survival signaling in murine hematopoietic progenitors."Mol.Cell.Biol.. 21. 854-864 (2001)
• [Publications] Ozawa,K.: "Gene therapy of Parkinson's disease using adeno-associated virus (AAV) vectors."J.Neural Transm. [suppl]. 58. 181-191 (2000)
• [Publications] Maeda,Y.: "Adeno-associated virus-mediated vascular endothelial growth factor gene transfer into cardiac myocytes."J.Cardiovasc.Pharm.. 36. 438-443 (2000)
• [Publications] Urabe,M.: "Self amplification system for recombinant adeno-associated virus production."Biochem. Biophys.Res.Commun.. 276. 559-563 (2000)
• [Publications] Shen,Y.: "Triple transduction with adeno-associated virus vectors expressing tyrosine hydroxytase, aromatic 1-amino acid decarboxylase, and GTP cyclohydrolase 1 for gene therapy of Parkinson's disease."Hum.Gene Ther.. 11. 1509-1519 (2000)
• [Publications] Maeda,y.: "Endogenously generated nitric oxide by nitric-oxide synthase gene transfer inhibits cellular proliferation."J.Phamacol.Exp.Therapeut.. 292. 387-393 (2000)
• [Publications] Shimpo,M.: "Gene transfer into rat renal cells using adeno-associated virus vectors."Am.J.Naphrol.. 20. 242-247 (2000)
• [Publications] Shimazaki,K.: "Adeno-associated virus vector-mediated bcl-2 gene transfer into post-ischemic gerbil brain in vivo : prospects for gene therapy of ischemia-induced neuronal death."Gene Ther.. 7. 1244-1249 (2000)
• [Publications] Kume,A.: "Long-term tracking of murine hematopoietic cells transduced with a bicistronic retrovirus containing CD24 and EGFP genes."Gene Ther.. 7. 1193-1199 (2000)
• [Publications] Matsuda,K.M.: "A novel strategy for the tumor angiogenesis-targeted gene therapy : Generation of angiostatin endogenous plasminogen by protease gene transfer."Cancer Gene Ther.. 7. 589-596 (2000)
• [Publications] Muroi,K.: "Autologous peripheral blood stem cell transplantation for adults with B-lineage acute lymphoblastic leukemia : a pilot study."Leukemia Lymphoma. 38. 103-111 (2000)
• [Publications] Urabe,M.: "DNA/calcium phosphate precipiates mixed with medium are stable and maintain high transduction efficiency."Anal.Biochem.. 278. 91-92 (2000)
• [Publications] Ozawa,K.: "Progress in Gene Therapy - Basic and Clinical Frontiers."VSP BV, Netherlands (ed.by Bertolotti,R.,Parvez,S.H.,and Nagatsu,T.). 18 (2000)
• [Publications] Hanazono,Y.: "Cell Therapy"Springer-Verlag, Tokyo (ed.by Ikeda,Y.,Hata,J.,Koyasu,S.,Kawakami,Y.,Hattori,Y.). 11 (2000)