1999 Fiscal Year Annual Research Report
細胞膜結合型プロセッシング酵素に対する新しい蛍光基質の作製とその応用
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11557138
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
加藤 有三 長崎大学, 歯学部, 教授 (20014128)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柴田 光枝 長崎大学, 歯学部, 助手 (20274665)
粟屋 昭 三井製薬工業, 製品計画部, 主席部員
坂井 英昭 長崎大学, 歯学部, 助教授 (40225769)
坂井 詠子 長崎大学, 歯学部, 教務職員 (10176612)
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| Keywords | 破骨細胞 / ODF / プロセッシング / OPG / メタロプロテアーゼ / ADAM |
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| Research Abstract |
破骨細胞形成に必須の因子であるODF(Osteoclast Differentiation Factor,破骨細胞分化因子)はTNFファミリータンパク質に属する膜結合タンパク質であり、遊離型の存在が知られている。しかし、その切り出し(プロセッシング)に関わる酵素は同定されていない。本研究はその酵素の同定を最終目的としている。本年度は破骨細胞形成支持能のあるST2細胞において、遊離型ODFの産生を確認し、膜結合型分子からのプロセッシング様式の検討を行った。ST2細胞は通常ODFを産生していないが、dexamethasone処理を行うことにより時間依存的にODFの産生が認められ、48時間後には多量の膜結合型ODF(分子量約40kDa)の発現を認めた。一方、培養液中には分子量約30kDaの遊離型ODFの存在が認められた。その存在量は膜結合型の約1/10以下であった。遊離型ODFの同定は、ODFのおとり受容体であるosteoprotegerinを固相化したresinでODFを沈降させWestern blottingで検出するLRP(ligand-receptor precipitation)法によって行った。このLRP法をスケールアップして行い、ST2培養上清より大量に遊離型ODFを調整しそのN-末端のアミノ酸シークエンスを行った。その結果、膜結合型からの切断点はArg(138)-Phe(139)であることが判明した。この切断はメタロプロテアーゼ阻害剤であるKB8301で完全に抑制された。切断酵素としては、ADAMファミリータンパク質ともよばれるメタロプロテアーゼ・ディスインテグリンファミリータンパク質が最大の候補である。現在15種類知られている分子種のうち、ST2細胞では少なくともTACE(ADAM17)とKuzbanian(ADAM10)のmRNAが発現していることがRT-PCRで確認された。
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[Publications] Kobayashi E.T.et al: "Force induced rapid changes in cell face at midpalatal Suture cartilage of growing rats"J.Dent.Res. 78・9. 1495-1504 (1999)
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[Publications] Yasuda Y.et al: "Rde of N-glycosylation in cathepsin E: A Comparative study of cathepsin E with distinct N-linked oligpsaccharicles and its nonglylosylated mutant"Eur.J.Biochem. 266・2. 383-391 (1999)
