ERGIC-53糖結合特異性改変による小胞輸送の改変と分泌蛋白質糖鎖構造の制御

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11557178
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 山本 一夫 東京大学, 大学院・新領域創成科学研究所, 教授 (20174782)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松本 直樹 東京大学, 大学院・新領域創成科学研究所, 助教授 (40239108)
• Keywords: ERGIC-53 / レクチン / 細胞内輸送 / 糖結合特異性

Research Abstract

細胞内のトランスポーターであるERGIC-53は、その内腔側に糖結合性のレクチンドメインを持っている。このドメインをそれと相同性をもつ種々の植物マメ科レクチンと入れ替えたキメラ分子の作製を行った。組み換えた相手の分子は、ガラクトースに特異性を持つBPAレクチンとシアル酸に特異性を持つMAHレクチンであり、いずれも我々がcDNAクローニングを行ったものである。発現の系は、mammaliannの細胞系はpRC/CMV2に、大腸菌の系はpET-3cに、そしてバキュロウイルスの系は、pB-dualのベクターをそれぞれ用いた。大腸菌ならびにバキュロウイルスの発現系は、mammalianの系での発現や細胞内の局在を追いかけるための抗体作りに用いる目的であり、膜貫通部位を除いた可溶性型になるように設計を行った。一方pRC/CMV2に関しては、発現はトランスポートの実験系でよく使われている犬腎臓由来MDCK細胞を用い、リポフェクトアミンを用いてトランスフォーメーションを行った。G418での選別の後、限界希釈法によって複数の変異体細胞を取得した。これら細胞での発現の確認を、取りあえず抗MAHレクチン抗体を用いて、免疫沈降法およびウエスタンプロットにより確認を行ったが、その発現効率が悪く検出が僅かであったために、新たにCD8分子のシグナル配列と7アミノ酸からなるFLAG配列を5'末端側につなぎ、発現効率を上げることと抗体に容易に認識できるようにタグを結合させる試みを行った。また、細胞内の輸送経路を改変することを目的に、細胞質側(C末端側)の輸送シグナル配列を改変することも同時に試みている。

Research Products

• [Publications] 山本一夫 他2名: "A chimeric lectin formed from Bauhinia purpurealectin and Lens culinaris lectin recognizes a unique carbohydrate structure"J,Biochem.. 127(1). 129-135 (2000)
• [Publications] 山本一夫 他2名: "Cybrorg lectins : Novel leguminous lectins with unique specificities"J,Biochem.. 127(1). 137-142 (2000)