肝細胞増殖因子活性化酵素(HGFA)を用いた融合タンパク質限定分解システムの開発

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11557181
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Tokyo Institute of Technology
• Principal Investigator: 宮澤 恵二 東京工業大学, 生命理工学部, 助教授 (40209896)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 下村 猛 三菱東京製薬, 創薬基盤研究所, 主管研究員 ; 喜多村 直実 東京工業大学, 生命理工学部, 教授 (80107424)
• Keywords: プロテアーゼ / 融合タンパク質 / 限定分解 / 組換えタンパク質

Research Abstract

本研究は肝細胞増殖因子活性化酵素(HGFA)の優れた基質特異性を利用して、副反応(目的タンパク質の切断)が少ない融合タンパク質限定分解システムを開発することを目指している。本年度は実用的な系において至適条件を検討するためにHGFAの基質ペプチド配列をGST融合タンパク質に導入し、限定分解反応を確認した。
pGEX4T-3ベクターはGST融合タンパク質の切断酵素としてトロンビンを用いるシステムである。このベクターのトロンビン切断配列の下流に、HGFA切断配列(AKTKQLRVVNG)をコードするオリゴヌクレオチドを挿入した。この配列はHGF上でHGFAによる限定分解部位近傍に由来する。融合タンパク質の例としては細胞内のシグナル伝達分子であるJIP-1(JNK interacting protein-1)を用いた。JIP-1はGST融合タンパク質として大腸菌に発現できるが、トロンビンにより完全に分解されてしまうことを既に見い出している。
発現したタンパク質をトロンビンおよびHGFAにより基質酵素比50:1の条件にて37℃、4時間処理をおこなった。トロンビン処理によりJIP-1-GSTはGST部分を残して完全に分解された。いっぽう、HGFA処理では融合タンパク質の限定分解のみがおこった。したがって、特異性の面では期待通り、副反応が低いことがわかった。
ついで切断効率の検討をおこなった。HGFを基質とした場合、基質酵素比10,000:1の条件においても37℃4時間処理によって限定分解はほぼ完全に進行した。いっぽう、GST-JIP1を基質に用いたときは、完全限定分解には100:1の比が必要であった。
今後は、HGFA切断配列近傍に変異を導入することによって効率の向上を試みるとともに、天然基質と人工基質の分解性の違いを規定する因子について追究する必要がある。

Research Products

• [Publications] Shimomura T.et al.: "Multiple sites of proteolytic cleavage to release soluble forms of hepatocyte growth factor activator inhibitor type 1 from a transmembrane form"J.Biochem.. 126. 821-828 (1999)
• [Publications] Itoh H.et al.: "Mouse hepatocyte growth factor activator gene: its expression not only in the liver but also in the gastrointestinal tract"Biochim.Biophys.Acta. (印刷中). (2000)
• [Publications] Leppanen O.-P.et al.: "Predimerization of recombinant platelet-derived growth factor receptor extracellular domains increases antagonistic potency"Biochemistry. (印刷中). (2000)