アデノウイルスの逆行性軸索輸送法による遺伝子治療法の開発:リーラーマウスを用いて

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11558091
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 寺島 俊雄 神戸大学, 医学部, 教授 (20101892)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岡戸 晴生 財団法人 東京都神経科学総合研究所, 病態神経生理学部門, 主任研究員 (60221842) ; 吉川 知志 神戸大学, 医学部, 助手 (90244681)
• Keywords: アデノウイルス / 遺伝子導入 / リーラーマウス / カハール・レチウス細胞 / 神経奇形マウス / リーリン / 遺伝子治療

Research Abstract

本年度は、CAGプロモーターと大腸菌βガラクシトダーゼをコードする遺伝子LacZあるいはgreen Fluorescent Protein(GFP)遺伝子を導入した組換えE1a・E3欠損型アデノウイルスベクター(Adex1CALacz)を、ヒト胎児由来293細胞で増殖後、高力価ウイルス液を作成することに成功した。そして膣栓確認後12日-21日の妊娠マウスを麻酔し、子宮壁越しに、ガラスピペットを用いてウイルス液をカハール・レチウスニューロンが軸索を伸ばす大脳皮質深層に注入した。注入後、1日から数日の期間をおいて、4%パラフォルムアルデヒドで動物を潅流後、脳を取りだし、同一固定液に2時間浸漬後、クリオスタットにて40μmの凍結切片を作成し、ゼラチン塗布スライドに切片を貼付した。Lac Z組換えアデノウイルスの場合は、X-gal染色あるいはβガラクシトダーゼに対する抗体を用いた免疫染色および電顕観察により、GFP遺伝子組換えアデノウイルスの場合は、蛍光顕微鏡により標識ニューロンの分布を調べたところ、注入後1日目に大脳皮質の分子層にあるハール・レチウスニューロンがX-gal陽性であった。したがって組換えアデノウイルスは、カハール・レチウスニューロンの皮質板内の神経終末より感染して、軸索内を逆行性に輸送され、辺縁層中の細胞体において転写・翻訳を開始しすることがわかった。今後、輸送されたウイルスゲノムがどのくらいの期間発現し、またどのような経過でDNAヌクレアーゼにより処理されて機能を失っていくかを調べる予定である。
今年度は、上記の実験の他にリーラー奇形マウスの病因遺伝子リーリンの翻訳領域全長のうち、5'側のシグナル配列を含む領域1kbpから3kbpをアデノウイルス発現カセットAdex1CALaczに組み込むことにも成功した。雌雄のリーラーへテロマウス(rl/+)を交配し膣栓確認後12日から21日の母親マウスを開腹し、子宮壁越しにリーリン遺伝子組換えアデノウイルスベクターを胎児大脳皮質に注入した。注入してから1日-数日後に胎児を潅流固定し、大脳のクリオスタット切片を作成する。抗リーリン抗体を用いた免疫組織化学とリーリンRNAを用いたin situ hybridization法を行ったところ、期待した導入リーリン遺伝子によるリーリン蛋白の発現が得られなかったので、次年度以降の課題としたい。

Research Products

• [Publications] Woodhams,P.L.: "Laminar boundaries persist in the hippocampal dentate molecular layer of the mutant shaking rat Kawasaki despite aberrant granucle cell migration"Journal of Comparative Neurology. 409. 57-70 (1999)
• [Publications] 寺島俊雄: "リーラーマウス顔面神経核の細胞構築異常"解剖学雑誌. 77(4). 411-420 (1999)
• [Publications] 寺島俊雄: "マウス大脳皮質の形成異常:リーラーマウスを中心に"脳の化学. 21(12). 1319-1324 (1999)
• [Publications] 寺島俊雄: "組換えアデノウイルスを用いた神経回路標識法"蛋白質核酸酵素. 45(3). 537-547 (2000)